乳制品細菌總數霉菌酵母快速檢驗方法的研究

夏元鳳 劉旭 潘玉愛 周宇晨

大連產品質量檢驗檢測研究院有限公司 遼寧大連 116033

乳制品細菌總數的把控，是食品衛生安全管理的重點內容，選擇科學合理的檢驗方法十分重要。目前我國的乳制品細菌總數檢驗中，多是選擇平板培養方法實現，耗時大概在40h以上，檢測耗時長、成本高。面對不斷增長的檢驗要求，傳統的檢驗方法局限性愈加明顯，無法滿足實際工作需求，迫切的需要整合乳制品檢測資源，積極推動檢測方法創新優化，力求在提升檢測效率和質量同時，盡可能降低檢測成本。

1 乳制品細菌總數快速檢驗方法

流式細胞法：流式細胞法（Flow Cyto metry，FCM）是一項能夠對高壓驅動的樣品流中單個受激光照射的細胞進行快速檢測的技術，可以用于細菌、霉菌毒素和病毒等微生物的快速檢測，在腫瘤學、微生物學、免疫學、血液學和環保、水處理及農業生產中都有重要的應用。流式細胞法進行細胞檢測具有綜合性、速度快和參數多的特點，該方法集合了激光、計算機和圖像等多項技術以及流體力學、單克隆抗體技術、細胞化學等多個領域的知識和成果，可以在1s內對數萬個細胞的理化特性等多個參數進行檢測。例如，Laplace-Builhe等使用FCM快速檢測酸奶和奶酪中的乳球菌；Malaerino等使用FCM檢測啤酒里存活細菌數量，并取得了和標準平板菌落計數一致的結果；FCM還可以同時檢測活菌和死亡細菌的數量。

伏安法是電勢控制法一種，這類方法電極電勢強制依附于已知程序，電勢控制在恒定值或按預先確定方式隨時間變化，測量電流作為時間或電勢函數。伏安法測定食品中的細菌只需半小時左右，為食品的衛生防疫和監督管理提供一種快速有效方法。在無菌箱內，準確吸取一定量的待測乳制品，加入預先置入細菌濾膜的微型油濾器中。開啟真空泵，迅速抽濾制成細菌阻留膜，把此膜附著在無菌罩中的玻碳電極上，插入以不同緩沖溶液為底液的反應池中，控制電解池內溫度為25℃，選擇不同的參比電極，以鉑電極作為輔助電極，以不同的時間進行伏安測定，以100mV/s的掃速，在0～1.5V范圍掃描，記錄伏安掃描曲線。所得峰電流值與相應樣品的校正工作曲線對照，計算樣品的細菌總數。

2 乳制品霉菌快速檢驗方法

霉菌和酵母菌同屬真菌類，具有相似的生理生化特征和細胞壁結構，因此乳制品中霉菌的檢測方法與酵母菌的檢測方法類似。由表1可以看出，霉菌菌絲和孢子的直徑均在3μm以上，大于牛奶中各組分的尺寸，因此可以用孔徑為3μm的微孔濾膜過濾酸奶，以實現對酸奶中霉菌的富集。霉菌屬于真菌類，細胞壁分為三層，外層是無定型的β葡聚糖，中層是糖蛋白，內層是幾丁質纖維，與酵母菌的細胞壁結構相似，試驗發現2μL的酵母菌濃縮液用3μL0.02%濃度的次甲基藍染液染色即可達到較好的效果，始于微生物快速檢測系統的處理和計數。

表1 牛奶中各組分的尺寸

在無菌操作環境下，取1mL酸奶于小試管中，加入9mL生理鹽水稀釋10倍，制成待檢樣品。用無菌針管吸取5mL待檢樣品，通過孔徑為3μm的微孔濾膜過濾，然后再打入50μL無菌空氣，用針管反復吹吸幾次使濃縮菌液混勻。用微量移液器取出濾膜上方2μL液體滴在玻片相應的位置上，自然晾干后在菌膜處滴加3μL濃度為0.02%的次甲基藍染液，染色1min，用滴管吸取蒸餾水輕輕沖掉染液，晾干后插入微生物快速檢測系統檢測。

3 乳制品酵母快速檢驗方法

酵母菌在厭氧條件下發酵產生乙醇，在酸性條件下乙醇能被橙紅色的重鉻酸根離子氧化，而重鉻酸根離子還原成灰綠色的三價鉻離子。反應方程式如下：

產生的Cr3+在波長為594nm光下有最大吸收峰，吸光度值與Cr3+濃度呈線性關系。由表1可知，除脂肪球以外酵母菌的尺寸跟跟牛奶中的其他組分沒有重復區域，因此可以利用1.2μm的濾膜過濾達到酵母菌富集的目的。

在超凈工作臺中，用量筒量取50mL無菌生理鹽水于錐形瓶中，加入安琪酵母0.5g，晃動充分混勻后用棉塞封口，在恒溫培養箱中35℃活化30min。①酵母菌染色條件的確定。在無菌環境下用移液槍吸取上述活化酵母菌菌液2μL，在模板比對下滴于載玻片的中央位置，倒置載玻片室溫下自然晾干。將載玻片背面在酒精燈火焰上放迅速通過2-3次，以感覺不燙手為宜，此時酵母菌菌體緊貼在載玻片上。然后取3μL染液滴在載玻片上覆蓋菌膜，一段時間后用無菌水緩慢沖洗，晾干后用微生物快速檢測儀觀察。②驗證方法的可行性。在無菌操作環境下，取1mL酸奶于試管中，用生理鹽水稀釋10倍。取1mL活化的酵母菌液加入到9mL稀釋后的酸奶中，攪拌混勻后用無菌水稀釋10倍制成待檢樣品。用注射器吸取樣品5mL，在孔徑為1.2μm的微孔濾膜上過濾，然后再向濾膜中打入50μL無菌空氣，此時微孔濾膜的上層截流液剩下20μL，反復吹吸使濃縮菌液混勻，截流液即為含有酵母菌的濃縮液，過濾后用微量移液槍從過濾器中吸取2μL截流液，滴于載玻片上染色制片鏡檢。同時，吸取2μL截流液于無菌培養皿上，用1mL生理鹽水稀釋后，傾倒孟加拉紅培養基制作平板，做3個平行，在恒溫培養箱中25℃培養48h，觀察計數。吸取濾液1mL于無菌培養皿上，用孟加拉紅培養基傾倒平板，做3個平行，恒溫培養箱中25℃培養48h，觀察計數。

4 結語

總而言之，20世紀60年代開始，許多發達國家已經開始進行微生物快速檢測技術的研究，快速檢測的試劑、試劑盒和儀器廣泛使用，但是檢測費用昂貴。建立一種測定準確、運行成本低、操作簡便的快速檢測方法對于乳品行業來說具有巨大的經濟價值。這就要求我們在以后的實際工作中必須對其實現進一步研究探討。