禿瘡花唇膚康噴劑的抑菌殺菌試驗

張莉敏，常攀峰，馬志宏，孫春香，茍想珍，黨 巖

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000)

禿瘡花又稱禿子花、紅荗草、勒馬回(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，是罌粟科中禿瘡花屬的2年或多年生長植物,分布在甘肅隴東等地。自20世紀80年代以來，我們國家的眾多學(xué)者對禿瘡花的化學(xué)成份、藥物有效成份及禿瘡花藥物有效成份的藥理作用都進行支持不歇的研究,從植物禿瘡花中提取出禿瘡花堿、別隱品堿、紫堇堿、原阿片堿、異紫堇堿、青風(fēng)藤堿等多種化合物。研究表明，禿瘡花藥物有效成份對結(jié)核病和肝炎等疾病均有良好的治愈作用。金銀花、大青葉、黃芩、蒼術(shù)、連翹、黃柏、魚腥草和甘草多是清熱解毒類中草藥，均有抗微生物和抗炎的作用，同時這些中草藥之間有較好的協(xié)同作用。上述這些中草藥不僅具有良好抗微生物作用，而且有調(diào)節(jié)動物機體免疫系統(tǒng)的機能從而促使動物機體的傷口愈合。中草藥中的成分易于分解代謝，對人類綠色環(huán)保和公共衛(wèi)生有重要的意義。

因此我們以甘肅隴東特色藥用植物禿瘡花(俗稱紅荗草，勒馬回)為藥材，研制具有抗菌消炎及抗病毒的獸醫(yī)臨床制劑，我們的項目進行了禿瘡花制劑工藝、藥效學(xué)、藥物代謝動力學(xué)以及化學(xué)成分的研究工作和臨床應(yīng)用試驗。本文僅就禿瘡花唇膚康噴劑的抑菌殺菌試驗進行論述，其它實驗部分另文發(fā)表。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電熱培養(yǎng)箱等儀器來自于甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所的中心實驗室。

1.1.2 菌株 試驗中所用的全部菌株來自于甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所實驗室。

1.1.3 藥材 禿瘡花采自于甘肅省平?jīng)鍪校⒂商m州物理化學(xué)研究所的天然藥物實驗室進行了鑒定；大青葉、連翹、黃柏、魚腥草、黃芩、金銀花、甘草和蒼術(shù)采購于甘肅省醫(yī)藥公司，并由蘭州物理化學(xué)研究所的天然藥物實驗室進行了鑒定。

1.1.4 實驗試劑 牛肉膏 、葡萄糖、N aO H 、蛋白胨、瓊脂 、酚紅 、磷酸氫二鉀 、N aCl購自于上海生工 ，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 禿瘡花外用制劑A液的制備方法 (1)用電子天平準確稱取金銀花3～4份、蒼術(shù)2～3份、連翹3～4份、黃芩3～4份、黃柏3～4份、大青葉3～4份、魚腥草2～3份和甘草2～3份，除蒼術(shù)裝入多個多層沙布袋內(nèi)用100～200 mL 95%酒精在另一容器密封浸泡外，其它藥物倒入瓷煲鍋中,在煲鍋中加入二蒸水1 600～2 000 mL、無水乙醇400～500 mL(分析純)、苯甲醇(分析純)5～15 mL和甘油(分析純)5～15 mL，攪拌均勻后用鹽酸(分析純)調(diào)pH至5.0～6.0，密封浸泡。每隔30～60 min攪拌一次。如此將藥物浸泡12～24h。(2)藥物浸泡后，將蒼術(shù)藥包及藥液合并至煲鍋中攪拌均勻，加熱煮沸1.5～2 h，當藥液溫度降至50～60 C°后，過濾煲鍋中的藥液0～4 C°保存?zhèn)溆貌壋恋怼Ｈ缓笊n術(shù)藥包用100～200mL 95%酒精在另一容器密封浸泡，在煲鍋中加入二蒸水1600～2 000 mL、無水乙醇400～500 mL(分析純)、苯甲醇(分析純)5～15 mL和甘油(分析純)5～15 mL，攪拌均勻后用鹽酸(分析純)調(diào)pH至5.0～6.0，密封浸泡。每隔30～60 min攪拌一次，藥物浸泡12～24 h后，將蒼術(shù)藥包及藥液合并至煲鍋中，煲鍋加熱煮沸1.5～2 h，當藥液溫度降至50～60 C°后，過濾煲鍋中的藥液0～4 C°保存?zhèn)溆貌壋恋怼Ｈ绱酥貜?fù)3～4次。(3)棄藥渣，合并上述4～5次所得藥液，將藥液加熱蒸發(fā)進行濃縮至250～500 mL,當藥液溫度降至室溫后，過濾高壓滅菌后即得金銀花復(fù)方中藥外用消炎制劑，置0～4C°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 禿瘡花外用制劑B液的制備方法 (1)用電子天平準確稱取禿瘡花干粉末500～1000 g，裝入多個多層沙布袋內(nèi)，扎緊袋口置于瓷煲鍋中,加入二蒸水1 600～2 000 mL,無水乙醇400～500 mL(分析純),攪拌均勻后用鹽酸(分析純)調(diào)pH至2.0～3.0，密封浸泡。每隔30～60 min將每個藥袋充分擠壓一次。如此將藥袋浸泡12～24h。(2)將每個沙布藥袋中的藥液擰至煲鍋中，過濾煲鍋中的藥液并棄沉淀；過濾后的藥液和藥袋一同置于清洗后的煲鍋中，加熱煮沸1.5～2 h，當藥液溫度降至20～25 C°后，將每個沙布藥袋中的藥液擰至煲鍋中，過濾煲鍋中的藥液并棄沉淀；然后用1N的NaOH將藥液的pH值慢慢調(diào)至10.0～11.0，過濾沉淀備用；加熱煮沸1.5～2 h后，乘熱過濾煲鍋中的藥液并棄沉淀，用1N的鹽酸慢慢調(diào)pH至2.0～3.0過濾沉淀備用；藥液倒出0～4 C°保存?zhèn)溆谩?3)再將藥袋置于煲鍋中，加入二蒸水1 600～2 000 mL,無水乙醇400～500 mL(分析純),攪拌均勻后用鹽酸(分析純)調(diào)pH值至2.0～3.0，每隔30～60分鐘將每個藥袋充分擠壓一次。如此將藥袋浸泡12～24 h; 加熱煮沸1.5～2 h，當藥液溫度降至20～25 C°后，將每個沙布藥袋中的藥液擰至煲鍋中，過濾煲鍋中的藥液并棄沉淀；然后用1N的NaOH將藥液的pH值慢慢調(diào)至10.0～11.0，過濾沉淀備用；加熱煮沸1.5～2 h后，乘熱過濾煲鍋中的藥液并棄沉淀，用1N的鹽酸慢慢調(diào)pH至2.0～3.0過濾沉淀備用；藥液倒出0～4 C°保存?zhèn)溆谩Ｈ绱酥貜?fù)3～4次。(4)棄藥袋，合并4～5次所得藥液，加50～150 mL苯甲醇和50～150 mL甘油，用1N的NaOH(分析純)將藥液pH值調(diào)至5.0～6.0，將藥液加熱蒸發(fā)進行濃縮至500～1 000 mL,當藥液溫度降至室溫后與藥物沉淀混合成懸液，高壓滅菌后即得禿瘡花外用制劑，置0～4 C°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 禿瘡花外用制劑的制備方法 (1)分別準確稱量下述體積份的各制劑：禿瘡花外用制劑B液1～3份，禿瘡花外用制劑A液1～3份，乙醇1～2份；(2)將禿瘡花外用制劑B液1～3份和禿瘡花外用制劑A液1～3份,各自溶解于1～2份滅菌二蒸水中，混合加熱至75～70 ℃攪拌；(3)等溫度降至25 ℃時，加入1～2乙醇，攪拌混勻成禿瘡花外用噴劑。

1.2.4 禿瘡花噴劑的抑制微生物試驗方法 組方組成：不同組方中所含的中草藥成份請見下表。

表1 不同組方中所含的中草藥成份

不同制劑的配制：組方1、組方2和組方3按禿瘡花噴劑A液的制備過程進行配制；組方4按禿瘡花噴劑B液的制備過程進行配制；組方5、組方6和組方7按禿瘡花噴劑的制備過程進行配制。

實驗方法：將實驗用的不同微生物種株進行純化后，接種于相應(yīng)的THB營養(yǎng)肉湯或酵母營養(yǎng)肉湯中，37 ℃或24 ℃培養(yǎng)24 h后，分別用平皿計數(shù)法進行計數(shù)配制成1000 cfu/mL的微生物懸液；分別將各微生物懸液100 μL,分別加入6 mL各制劑與相應(yīng)的營養(yǎng)肉湯按1∶1的比例制備的培養(yǎng)肉湯中,37 ℃或24 ℃培養(yǎng)16 h后用平皿計數(shù)法進行計數(shù)。最后按下列公式計算抑菌率:η=( C1～ C2)/C1×100%。,其中C1、C2分別是指對照管和試驗管的的菌落數(shù)。

1.2.5禿瘡花噴劑抑菌穩(wěn)定性試驗方法 (1)取制備好的禿瘡花復(fù)方中藥外用消炎噴劑A液和B液各500 mL，4 ℃條件下貯存1年。分別在剛完成制備時、4 ℃條件下貯存6個月和4 ℃條件下貯存1年時各取A液和B液150 mL蒸發(fā)濃縮10倍，按1∶1的體積比制成噴劑成，進行抑菌穩(wěn)定性試驗。(2)試驗菌液的制備方法:首先試驗用的各菌株進行一步分離且純化，接種于相應(yīng)的營養(yǎng)瓊脂平皿上，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)24 h后4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｕ皆囼炃?在無菌環(huán)境下挑出典型標準的菌落，無菌接種于相應(yīng)的普通營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24 h。然后在無菌環(huán)境下挑出典型標準的菌落，用劃線的方法接種于相對應(yīng)的瓊脂斜面上培養(yǎng)24 h后，再挑出典型標準的菌落，接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過37 ℃旋轉(zhuǎn)恒溫培養(yǎng)8 h后計數(shù),并將其配成1×103 CFU /mL的菌液以供正式試驗用。(3)禿瘡花噴劑的抑菌穩(wěn)定性試驗方法:取含N量為31 mg/mL禿瘡花噴劑，在相對應(yīng)的培養(yǎng)肉湯中對倍稀釋到1024倍,成為系列稀釋的藥物肉湯。然后取各組16～1024倍的系列濃度物做為試驗組，試驗對照組為末加藥物的相對應(yīng)的培養(yǎng)肉湯。試驗組及試驗對照組的試驗管先105 ℃高壓滅菌30 min后放置3～6 h使其溫度降至室溫后,在無菌條件下用移液管分別向各試驗管加10%被試菌液,試驗對照管用無菌生理鹽水代替菌液。然后將其37 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)14～18 h時間后,對各試驗管和對照管分別按常規(guī)細菌計數(shù)進行計數(shù),試驗重復(fù)3次，計數(shù)結(jié)果按此公式計算抑菌率:η=( D1～ D2)/D1×100%。(其中D1、D2分別是指對照管和試驗管的菌落數(shù)。)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 禿瘡花噴劑的抑制微生物試驗結(jié)果

各組方對不同微生物的抑菌率見表2。

表2 各組方對不同微生物的抑菌率

禿瘡花噴劑A液(組方1、組方2、組方3)和禿瘡花噴劑B液(組方6)都有良好的抗微生物的作用，但作用的譜系不同，二者共用的禿瘡花復(fù)方中藥外用消炎噴劑(組方7)能使組方的抗微生物的作用增加及抗微生物作用譜系更廣。

2.1.2 禿瘡花噴劑抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表3 禿瘡花噴劑抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

從禿瘡花噴劑抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果可以看出，禿瘡花噴劑，4 ℃條件下貯存1年，對大腸桿菌、鏈球菌和葡萄球菌均有較穩(wěn)定的抑菌作用效果，對不同種類的細菌禿瘡花噴劑殺菌抑菌濃度各有不同。

2.2 討論

實驗證明，盡管禿瘡花噴劑A液和禿瘡花噴劑B液都有良好的治療動物皮膚炎癥、潰瘍和外傷的作用(見參考文獻16)，但對于多種病因引起的同樣癥狀的疾病治療效果卻不一致，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因是對于多種病因引起的同樣臨床病狀的疾病單一的消炎制劑抗微生物譜系不一且相對比較窄。利用禿瘡花噴劑A液和禿瘡花噴劑B液之間對動物皮膚炎癥、潰瘍和外傷的相互協(xié)同作用，能增加藥物對動物皮膚炎癥、潰瘍和外傷的作用譜系范圍；能增強藥物對對動物皮膚炎癥、潰瘍和外傷的作用效能是研制禿瘡花復(fù)方中藥外用消炎噴劑的主要目的之一。同時，由于治療動物外部皮膚炎癥、潰瘍和外傷的特殊性——如治療工作人員的安全、動物口腔內(nèi)部等部位的治療困難、動物蹄部等部位藥物難以固定、動物外部皮膚炎癥潰瘍及外傷治療的群體性等等，因此根據(jù)動物不同部位和不同狀況的外部皮膚炎癥、潰瘍和外傷疾病，使用噴劑進行治療，能在確保治療療效的基礎(chǔ)上，簡化治療過程，節(jié)省治療時間，確保治療操作人員安全是研制禿瘡花噴劑的另一主要目的。