不同種類樣品檢測禽白血病P27抗原結果分析

柳 林，王曉玲，趙夢姣，陳 靜

(1.煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東 煙臺 264003；2.山東省動物疫病預防與控制中心)

2019年5月，在山東省煙臺市啟動了白羽肉雞主要疫病凈化示范區建設項目，這是全國第一個家禽疫病區域凈化項目，旨在深入落實《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》，推動《規模化養殖場主要動物疫病凈化和無害化排放技術集成與示范》項目實施，對推動我國家禽主要疫病凈化意義重大。禽白血病是白羽肉雞主要凈化疫病，是由禽白血病毒(ALV)引起的一類腫瘤性疾病。在雞群中流行的主要有六個亞群，其中ALV-J 亞群致病性和傳染性最強，主要傳播方式為垂直傳播和水平傳播。目前該病尚無有效的治療方法和疫苗預防，對種雞群實施監控和凈化是控制該病有效的方法之一，最常用的檢測方法是檢測p27 抗原，檢測的樣品為稀蛋清、泄殖腔拭子、胎糞等，其中應用最廣泛是蛋清p27抗原檢測。本文利用酶聯免疫吸附試驗的方法對泄殖腔棉拭子、蛋清 p27 抗原進行檢測，分析其結果的差異性，進一步評估泄殖腔棉拭子p27 抗原檢測結果應用的局限性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

抽樣原則為場點全覆蓋、隨機性、真實性，保證所采的樣品具有代表性。在全市10個縣市區抽取養殖場戶31個，包括2個祖代場、29個父母代場，共采集種蛋900枚、咽喉/泄殖腔棉拭子900份。要求種蛋新鮮，咽喉/泄殖腔棉拭子置于同一個離心管中，種蛋和咽喉/泄殖腔棉拭子，應來自于同一棟舍。

1.2 樣品處理

1.2.1 種蛋處理 種蛋放在蛋盤中冷藏2 d，恢復至室溫，酒精棉球擦拭雞蛋大頭進行滅菌，再用鑷子在雞蛋的大頭處打開一小孔，可見氣室，從破殼處沿著蛋殼內壁挑破蛋膜，使用1 mL剪去尖頭滅菌槍尖抽取蛋清約1 mL，放于1.5 mL EP管中，冷凍保存。

1.2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子采集及處理 雞只呈側臥位保定，手持棉簽伸入雞喉頭內或泄殖腔約1.5～2.0 cm，棉頭緊帖腔內壁旋轉 2～3 圈，取出后裝入EP管中，折斷棉簽保留棉頭，采集樣品后盡快送到實驗室進行檢測。加入IDEXX 試劑盒中配備的樣品稀釋液1 mL，冷藏保存過夜，檢測前2 000r/min 離心 5min，取上清液。

1.3 檢測方法

檢測蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原試劑盒購自美國IDEXX公司(批號：FR481)按照說明書進行檢測。

2 結果

2.1 蛋清p27抗原檢測結果

在10個縣市區中，有5個縣檢測出p27抗原陽性，分別位于萊陽市、海陽市、萊州市、招遠市、牟平區，陽性率分別為2.2%、1.7%、1.7%、3.3%、0.7%；全市采集共900枚種蛋，檢出p27抗原陽性9份，總體陽性率為1.0%，詳見表1和圖1。

表1 蛋清禽白血病p27抗原檢測結果

圖1 蛋清禽白血病p27抗原檢測結果

2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原檢測結果

在10個縣市區中，有6個縣檢測出p27抗原陽性，分別位于萊陽市、棲霞市、海陽市、蓬萊市、招遠市、牟平區，陽性率分別為3.3%、1.7%、3.3%、1.3%、7.8%、1.3%；900份咽喉/泄殖腔棉拭子，檢出p27抗原陽性19份，總體陽性率為2.1%，詳見表2和圖2。

表2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原檢測結果

圖2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原檢測結果

2.3 檢測結果比較使用美國IDEXX公司p27抗原試劑盒對蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子進行檢測，檢出蛋清陽性9份，陽性檢出率為1%，檢出咽喉/泄殖腔棉拭子陽性19份，陽性檢出率為2.1%，檢測結果相差較大，詳見表3。

表3 不同種類樣品禽白血病p27抗原檢測結果比較

3 討論

我國是全球第一大肉雞生產國，白羽肉雞是主要品種，煙臺白羽肉雞的市場占有率約為全國75%。在白羽肉雞產業蓬勃發展的同時，也面臨著巨大挑戰，疫病流行對養殖業發展構成嚴重威脅。白羽肉雞生長周期短，禽白血病傳隨著代次不斷繁衍，流行和發病情況日趨嚴重。控制該病的主要措施是對禽白血病實施區域管控，進行大規模流行病學調查，淘汰陽性雞只，凈化雞群。由于內源性ALV幾乎無致病性，但會對外源性ALV的檢測和鑒別造成干擾，目前，市場化應用最廣泛的抗原試劑盒為美國IDEXX公司p27抗原試劑盒，還不能有效區分內源性和外源性的感染，所以選擇有效的實驗室檢測方法和方式尤為重要。

本文對種雞群900份咽喉/泄殖腔棉拭子進行ALV-p27抗原ELISA檢測，陽性20份，陽性檢出率為2.2%，對種雞群900枚雞蛋檢測，蛋清ALV-p27抗原檢測出陽性9份，陽性檢出率為1%，蛋清檢出率遠低于咽喉/泄殖腔棉拭子。以縣市區為例，在萊陽市、棲霞市、海陽市、蓬萊市、招遠市、牟平區，蛋清p27抗原ELISA檢測陽性率低于咽喉/泄殖腔棉拭子檢測陽性率。而在萊州市，蛋清p27抗原檢測出1份陽性，咽喉/泄殖腔棉拭未檢出，可能是存在漏檢；也可能是在采樣環節，采集的雞蛋和咽喉/泄殖腔棉拭雖來自同一雞舍，但不是來自同一只雞的緣故。在龍口市、開發區、福山區，均未檢測ALV-p27抗原。綜上，禽白血病實驗室檢測環節中，蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢出率都不相同，且兩者之間的檢測結果無明顯的相關性。

2015年，沈學懷報道過，成年雞以泄殖腔棉拭子作為 ELISA ALV-p27抗原檢測材料存在假陽性結果。2017年，陳俊霞報道過，不同類型雞的泄殖腔棉拭子 ALV-p27抗原檢測法不僅有很高的假陽性率，還有一定比例的漏檢率。2018年，黃秀英報道過，泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測不適合作為禽白血病凈化的檢測指標。本文通過ELISA試驗檢測蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，證實兩者不同的樣品檢出率都不相同，且之間的檢測結果無明顯的相關性，這與之前報道過的結果，具有一致性。在下一步制定種雞場禽白血病凈化路線時，應排除咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原的檢測方案，不能以泄殖腔棉拭子作為檢測材料。本試驗證實了咽喉/泄殖腔棉拭子p27 抗原檢測結果應用的局限性，為白羽肉雞禽白血病凈化檢測方案的制定提供參考依據。