中獸醫學大腸濕熱泄瀉模型的建立

張 亮

(甘肅畜牧工程職業技術學院，甘肅 武威733006)

攜帶一些特殊血清的大腸桿菌中可導致人和動物患病，常常引起嬰兒和幼畜(禽)嚴重腹瀉和敗血癥。中國藥典2010版收錄了一種名為番瀉葉的瀉下導滯藥之一，番瀉葉是由豆科植物狹葉番瀉或者光葉番瀉的干燥小葉組成。灌胃番瀉葉可誘導大鼠體內的濕熱毒素下行，經腸道排出體外，從而損傷大腸。因此，本實驗是用高溫高濕+大腸桿菌組，高溫高濕+番瀉葉組，高溫高濕組等來模擬大鼠大腸濕熱泄瀉模型，觀察大鼠的腹瀉指數(稀便率+稀便指數)，臨床表現(行為學、飲水量、采食量、體重、體溫、尿量)來判斷是否成功建立濕熱泄瀉模型，從三種方法中選擇何種方法更適合用于建立中獸醫大腸濕熱證的模型，為進一步闡明大腸濕熱證發病的病因、機理及其特點提供研究基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥品和試劑

產毒性大腸桿菌標準株(菌號：44711)、蜂蜜水(20%)、白酒(二鍋頭56°)、豬油、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、生理鹽水、新潔爾滅、蒸餾水。

1.2 實驗儀器

KMD型調溫電熱套；多用真空泵(鄭州)；RE-6000旋轉蒸發儀； SHA-B恒溫振蕩器；KQ-300ED型數控超聲清洗器；大鼠代謝籠；烘干箱；壓力蒸汽滅菌器、恒溫水浴鍋注射器、試管架等。

2 實驗設計與方法

2.1 高溫倉的搭建

自制高溫倉，模擬夏季高溫高濕環境，溫度范圍(35±1℃)，濕度范圍(85%～90%)。

2.2 番瀉葉水煎液的制備

采購自蘭州黃河藥材市場的番瀉葉樣品稱取400 g，加1200 mL蒸餾水浸泡和煮沸各1 h，取上清液，濾渣加蒸餾水600 mL，煮沸0.5 h，取上清液，合并兩次上清液，過濾，用旋轉蒸發儀濃縮至300 mL，然后用蒸餾水定容至400 mL，使其相當于含生藥 1 g/mL，保存于4℃冰箱中備用。

2.3 培養基的制備

營養肉湯培養基制作：混合牛肉膏3 g、NaCl5 g、蛋白胨10 g。加熱充分溶解于1 000 mL蒸餾水中，并分裝于三角瓶中，調pH至7.2，121℃高壓滅菌15 min，塞緊瓶塞，4℃冰箱貯存備用。

瓊脂培養基制作：混合蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，NaCl5 g和瓊脂15 g，將混合物充分溶解于1 000 mL蒸餾水中，加熱至完全溶解，分裝至三角瓶中，并于121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min，在超凈工作臺倒板，4℃無菌保存備用。

2.4 大腸桿菌的培養

經過細菌復蘇、平板篩選、傳代培養使用麥氏比濁法測定大腸桿菌，并用生理鹽水稀釋濃度至1×109mol/L。

2.5 動物分組與造模

由甘肅中醫學院動物實驗中心提供的實驗動物體重為160～180 g，雌雄 SD大鼠各20 只。用普通滅菌飼料飼喂大鼠，自由飲食和光照，保持溫度為20～30℃，濕度40%～60%，3 d后進行實驗。

采用完全隨機分組法將大鼠分為空白組，高溫高濕組，高溫高濕+番瀉葉組和高溫高濕+大腸桿菌組。每組大鼠10只，其中雌鼠和雄鼠各5只。

空白組：飼喂普通飼料，自由飲食，自然光照

高溫高濕模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續10 d；在第11天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL蒸餾水，24 h后重復一次。

高溫高濕+番瀉葉模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2 mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續10 d；在第11天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL 0.05 g/mL的番瀉葉水煎液，直到100%腹瀉。

高溫高濕+大腸桿菌模型組：單日飼喂普通飼料，雙日禁食并對每只大鼠灌胃2 mL豬油，每日給予足量的20%蜂蜜水。持續10 d；在第11 天移入高溫高濕倉(溫度為35±1℃；相對濕度為85%～90%)內8 h，每日飼喂普通飼料，并給予足量的白開水，持續5 d，第16天每只大鼠腹腔注射0.3 mL濃度為1×109mol/L的大腸桿菌懸液，24 h后重復一次。

所有模型組和空白組大鼠在造模完成后，觀察一天，并禁食不禁水24 h。

2.6 檢測指標

2.6.1 大鼠行為觀察 每日上午10點觀察記錄各組大鼠的精神狀態、活動情況、皮毛光澤度、體溫、食欲、糞便、飲水量、尿量、舌苔等。

2.6.2 大鼠采食量測量 在造模第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的采食量。

2.6.3 大鼠飲水量測量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的飲水量。

2.6.4 大鼠體重測量 在造模前1天測量各組大鼠的空腹體重，并在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的體重。

2.6.5 大鼠尿量測量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分別測量各組大鼠的尿量。

2.6.6 大鼠體溫(肛周)測量 每天下午4點分別測量造模前1天和造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天各組大鼠的肛周溫度。在第16天和17天上午9點和下午4點各測一次肛溫。

2.6.7 大鼠腹瀉率和腹瀉指數測量 模型組大鼠在腹腔注射大腸桿菌或灌胃番瀉葉后每觀察腹瀉情況，并計算腹瀉率和腹瀉指數。

稀便率=每只動物的稀便次數/大便的總次數(稀便以濾紙上有無污跡為標準)；

腹瀉指數=稀便率×稀便級。

稀便級別根據濾紙上污跡范圍的大小分為4級∶1級污跡直徑<1 cm；2級污跡直徑1.0～1.9 cm；3級污跡直徑2～3 cm；4級污跡直徑>3 cm。

3 結果分析

3.1 大鼠行為觀察

空白組大鼠一切行為正常。其它三組造模1～10 d內各模型組大鼠表現活躍，被毛光澤，食欲旺盛，尿量增多，表現為舌苔黃膩，個別大鼠出現鼻口紅腫和出血癥狀。造模第11～15天各模型組大鼠出現體溫升高，嗜睡，呆滯癥狀。表現為大鼠被毛雜亂無光澤，食欲和飲欲都有不同程度的降低，鼻口紅腫和出血的大鼠比例明顯增多，并出現糞便黏滯。在造模第16～17 d，大鼠精神更差，多數大鼠蜷臥一團，食欲和飲欲減少或廢絕，尿量減少，多數出現溏便和黏液便，個別大鼠有血便。

3.2 大鼠體重變化

圖1顯示在整個造模過程中空白組大鼠體重升高明顯，各模型組在高糖高脂階段均有升高的趨勢，但呈波浪式升高，可能與禁食有關，在高溫高濕階段，體重變化不明顯，略有降低；在灌胃番瀉葉和注射大腸桿菌后，這兩個模型組大鼠體重有明顯的下降，而高溫高濕模型組體重有明顯的上升。

圖1 各組大鼠體重變化趨勢折線圖(x±s)

3.3 大鼠采食量變化

圖2為各組大鼠采食量變化趨勢圖，造模前一天，各組大鼠禁食測量空腹體重，因此5.1日各組大鼠的采食量均有不同程度的升高，造模1～10 d內各模型組采食量變化不大，但均低于空白組，可能因為大鼠隔日禁食，脾胃損傷，導致采食量減少。高溫高濕階段各模型組大鼠采食量均有明顯的下降，尤其番瀉葉組和大腸桿菌組。

圖2 各組大鼠采食量變化趨勢折線圖(x±s)

3.4 大鼠飲水量變化

圖3各組大鼠飲水量變化趨勢圖，在高糖高脂階段各模型組飲水量是明顯升高的，呈波浪式升高，可能與禁食有關。在高溫高濕階段，飲水量急劇增加，可能與高溫有關，在注射大腸桿菌和灌服番瀉葉階段，飲水量幾乎呈現直線下降，尤其在5.16日以后比正常組均低，有可能是番瀉葉的損傷腸道和大腸桿菌的致病作用，導致飲水量比正常組低。

圖3 各組大鼠飲水量變化趨勢折線圖(x±s)

3.5 大鼠尿量變化

圖4各組大鼠尿量量變化趨勢圖，在高糖高脂階段各模型組尿量是明顯升高的，呈波浪式升高，可能與禁食有關。在高溫高濕階段，體內水分散發較快，導致尿量減少，因此，可能與高溫有關。注射大腸桿菌和灌服番瀉葉，尿量減少，有可能是番瀉葉的瀉下作用導致大量的水分損失，和大腸桿菌致病是老鼠出現腹瀉而喪失水分，因此尿量比正常組低。

圖4 各組大鼠尿量變化趨勢折線圖(x±s)

3.6 大鼠體溫變化

圖5各組大鼠體溫變化趨勢圖，在高糖高脂階段，各模型組的體溫均比正常組略高，所以此階段無可比性。在高溫高濕階段，注射大腸桿菌和灌服番瀉葉后，體溫明顯上升，番瀉葉組將近比正常組高出0.5℃，大腸桿菌組比正常組高出1℃。可能是大腸桿菌造成了濕熱主癥。

圖5 各組大鼠體溫變化趨勢折線圖(x±s)

3.6 大鼠腹瀉率和腹瀉指數變化

大腸桿菌組在第一次注射大腸桿菌32 h后出現全部腹瀉，腹瀉率100%。番瀉葉組在第一次灌胃番瀉葉24 h后出現前部腹瀉，腹瀉率100%。

經上述分析后得出結果，本實驗能成功建立濕熱泄瀉模型，而且大腸桿菌組最符合中獸醫學臨床特點的大腸濕熱泄瀉模型。

4 討論

以生化學因素、癥狀、指標、中藥復健治療為主要依據的大腸濕熱病證動物模型主要由外感暑濕、染疫癘之氣、飼喂霉敗穢濁或者有毒草料引發，以致損傷氣血而發病。

以飲食、氣候環境變化、大腸桿菌感染綜合因素所形成的濕熱泄瀉模型比較理想，尤其是濕熱證造模和大腸濕熱模型。等研究。本人在前人的基礎上，改良造模的方法，形成腹腔注射大腸桿菌配合飲食加環境復合法，復制大鼠大腸濕熱泄瀉模型，簡單易行、造模時間短、成功率高、重復性好，自愈時間長，并選取了行為學觀察，采食量、飲水量、尿量、體重、體溫、腹瀉率和腹瀉指數的變化說明模型的可靠性。結果表明，各模型組與空白組比較進入高溫高濕階段從行為學觀察各模型組大鼠雖然出現發熱，嗜睡，呆滯癥狀。表現為大鼠被毛雜亂無光澤，食欲和飲欲都有不同程度的降低，鼻口紅腫和出血的大鼠比例明顯增多，并出現少量糞便粘滯。說明高溫高濕不是引起大腸濕熱證的主要原因。注射大腸桿菌和灌服番瀉葉后大鼠精神更差，多數大鼠蜷臥一團，食欲和飲欲減少或廢絕，尿量減少，多數出現溏便和粘液便，個別大鼠有血便。此外大鼠體重降低，采食量均有明顯的下降，飲水量幾乎呈現直線下降，尤其在灌服番瀉葉和注射大腸桿菌以后比正常組均低，尿量呈現下降趨勢均比正常組低，體溫(大腸桿菌組)急劇上升，將近高達39℃。在從表1和表2中看出番瀉葉組在24 h內腹瀉率達到100%，大腸桿菌組在32 h內腹瀉率達到100%，且腹瀉指數與空白組比較都有有統計學意義(P<0.05)。因此大腸桿菌組是最符合濕熱模型。由此證明本實驗改良的造模方法是科學合理的。但是，本實驗還存在許多不足之處，光憑臨床癥狀及其一些體征變化及腹瀉率和腹瀉指數不一定判定為大腸濕熱證，有時會混合感染其他疾病，應該還從腸道的病理變化做組織切片檢查，還應該進一步檢測生化指標、免疫因子、血常規等。

表1 各組所致濕熱腹瀉大鼠腹瀉指數的情況(x±s)

表2 各組所致濕熱腹瀉大鼠腹瀉指數的情況(x±s)