沒食子酸對豬精液常溫保存的效果及濃度篩選

趙 琦，陳玲玲，孫 超

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，712100)

近年來，中國肉產(chǎn)量和消費(fèi)量都呈現(xiàn)快速增長趨勢，豬肉是我國國民不可缺少的肉食，我國豬肉消費(fèi)量占世界總量的50%，2019年我國豬肉進(jìn)口量總計(jì)為210.8萬t，國內(nèi)豬肉產(chǎn)量無法滿足國民需求，這就要求我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)需要快速發(fā)展。我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展不僅要求數(shù)量的增長，質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟(jì)效益需要共同發(fā)站，目前生豬養(yǎng)殖已從散戶養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧s化、規(guī)模化養(yǎng)殖。隨著人工授精技術(shù)的成熟和推廣，人工授精技術(shù)已成為目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要手段之一，該技術(shù)的應(yīng)用能夠解決公母豬之間因體型差異不能配種的問題、大量減少種公豬飼養(yǎng)數(shù)量及疾病的傳播從而在人力、財(cái)力、物力等方面節(jié)約了成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。精液保存是人工授精技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，豬精子對溫度敏感，溫度過低會(huì)導(dǎo)致精子冷休克，極易造成精子損傷，且這種現(xiàn)象是不可逆的，通常只有50%或者更少的精子能在低溫保存過程中存活。研究表明常溫保存的精子存活率高、妊娠率高，冷凍保存的精液存活率低，且成本更高，因此在實(shí)際生產(chǎn)中大多使用常溫保存的豬精液用于人工授精。豬精液常溫保存的原理是利用弱酸環(huán)境抑制精子的運(yùn)動(dòng)，隨著保存時(shí)間的延長活性氧會(huì)造成精子損傷，此外，采集的精液本身含有微生物，隨著保存時(shí)間的延長大量繁殖，消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)還會(huì)造成精子凝集，影響精子的運(yùn)動(dòng)能力，并降低受精能力和早期胚胎發(fā)育能力。沒食子酸(gallic acid) 是一種天然有機(jī)酚酸，具有較強(qiáng)的抗氧化性，抑菌及抗炎等生物學(xué)作用。GA對機(jī)體產(chǎn)生的多余活性氧類有顯著的清除作用，如DPPH自由基、羥自由基等，對脂質(zhì)過氧化也有明顯抑制效應(yīng)，同時(shí)具有清除一氧化氮(NO)的能力。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)豬精液 試驗(yàn)精液來源于3頭14月齡、身體健康的長白公豬，手握法采集精液，收集中段富含精子部分，過濾后放入便攜式保溫箱，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。選取色澤、氣味正常、CASA檢測后活率80%以上的精液待用。

1.1.2 試劑與儀器 沒食子酸，純度≧98%(分析標(biāo)準(zhǔn)品)，葡萄糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸氫鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、(北京索萊寶科技有限公司)，DAPI (10Ml，Solarbio )、FITC-PNA(1mg，Sigma)三羥基氨基甲烷(Tris) (北京索萊寶科技有限公司)。

主要儀器包括：豬精液質(zhì)量檢測系統(tǒng)、倒置熒光顯微鏡、離心機(jī)、立式壓力蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋、17℃恒溫箱、37℃培養(yǎng)箱、電子天平、微量移液器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 配置精液稀釋液 精液基礎(chǔ)稀釋液的配制：準(zhǔn)確稱量葡萄糖37.15 g、二水合檸檬酸鈉6.0 g、碳酸氫鈉1.25 g、氯化鉀0.75 g、EDTA1.25 g于滅菌燒杯中，取1 L雙蒸水對試劑進(jìn)行溶解。待完全溶解后，用0.22 μmol/L濾菌膜過濾于無菌玻璃瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸儲(chǔ)存液的配制：稱取10 mg沒食子酸，用1 mL DMSO充分溶解，配制成10mg/mL的沒食子酸儲(chǔ)存原液，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原精的質(zhì)量檢測 原精活率檢測：于37℃加熱板上預(yù)熱好的專用載玻片上滴10 μL原精，蓋預(yù)熱好的蓋玻片后，置于37 ℃恒溫載物臺(tái)上利用豬用CASA系統(tǒng)檢測精子活率，精子活率85%以上的精液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 精液的稀釋與保存 用基礎(chǔ)稀釋液對原精進(jìn)行稀釋，使其混合均勻。分裝于已滅菌離心管中并編號(hào)，用毛巾包裹，待精液溫度與室溫相近后放置在17 ℃恒溫箱中，至少每隔12 h 緩慢搖動(dòng)精液樣品一次，每隔24 h 檢查精子活率(以精子活率大于60%的天數(shù)為有效保存天數(shù))。

1.2.4 精子活率及A+B級(jí)精子數(shù)檢測 保存過程中每隔24 h進(jìn)行一次活率和A+B級(jí)精子數(shù)檢測，從17℃恒溫箱中取出精液樣品，緩慢搖勻后吸取中部樣品100 μL于1.5 mL離心管中，置于預(yù)熱好的37 ℃恒溫水浴鍋孵育5 min，孵育結(jié)束后取10 μL樣品滴至預(yù)熱后的載玻片，利用豬用CASA系統(tǒng)檢測精子活率以及A+B級(jí)精子數(shù)。每個(gè)樣品隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行測定并計(jì)數(shù)。

1.2.5 精子質(zhì)膜完整性檢測 取100 μL精液樣品于1.5 mL 離心管中，置于預(yù)熱好的37 ℃水浴中10 min使精子活化，加入配好的0.2μLSYBR-14 工作染液緩慢吹打混勻，37℃孵育7～10 min；加入 1μLPI 工作染液緩慢吹打混勻，孵育7～10 min。孵育結(jié)束后取10 μL 樣品滴于載玻片，蓋上蓋玻片，為防止熒光淬滅，快速置于熒光顯微鏡下拍照，選擇至少5個(gè)清晰的視野。

1.2.6 精子頂體完整性檢測 取30 μL精液滴于多聚賴氨酸處理粘附載玻片的一端，利用干凈蓋玻片均勻的涂抹于整個(gè)載玻片上，室內(nèi)自然風(fēng)干；風(fēng)干后滴加無水甲醇用于固定，甲醇揮發(fā)后取30 μLDAPI染液滴于載玻片，用蓋玻片輕刮至完全覆蓋樣品，室溫避光染色7～10 min；取30 μL FITC-PNA工作液，均勻的滴加于載玻片上，覆蓋樣品，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min；孵育結(jié)束后用PBS沖洗玻片，自然風(fēng)干后加少量甘油，蓋上干凈長蓋玻片，為防止熒光淬滅快速置于熒光顯微鏡下拍照，選取至少5個(gè)細(xì)胞數(shù)在兩百左右的視野。

1.2．7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，比較各組間的差異顯著性，所有指標(biāo)均采以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸對豬精子活率的影響

由表1可知，保存第1、9 天時(shí)，9 μg/mL組顯著高于對照組(P<0.05)；保存第3天時(shí)，3、5、7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)；第5天時(shí)，5、7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)；第7天時(shí)，7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)，第3～9天時(shí)10 μg/mL顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 不同濃度的沒食子酸對豬精子活率的影響

2.2 沒食子酸對豬A+B級(jí)精子數(shù)的影響

由表2可知，保存第1天，各濃度組與對照組相比無顯著差異間(P>0.05)；保存第3～9天時(shí) ，10μg/mL顯著低于對照組(P<0.05)；保存第5、9天時(shí) ，9 μg /mL組顯著高于對照組(P<0.05)；第7天時(shí)，9 μg/mL組極顯著高于對照組(P<0.01)。

表2 不同濃度的沒食子酸對豬A+B級(jí)精子數(shù)的影響

2.3 沒食子酸對豬精子質(zhì)膜完整性的影響

由圖1可知，保存第1天各組間無顯著差異(P>0.05)；保存第3 d，9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第5 d，6、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，10 μg/mL組顯著低于對照組(P<0.05)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第7 d，6、7、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照組(P<0.05)保存第9 d，9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05).

圖1 不同濃度的沒食子酸對豬精子質(zhì)膜完整性的影響

2.4 沒食子酸對豬精子頂體膜完整性的影響

由圖2可知，保存第1天，9μg/mL組精子頂體完整性顯著高于對照組(P<0.05)，其他各濃度組間無顯著差異間(P>0.05)；保存第3天，9μg/mL組精子質(zhì)膜頂體極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第5天， 5、8μg/mL組精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照組(P<0.05)，9 μg/mL組精子質(zhì)膜頂體極顯著高于對照組(P<0.01)，10 μg/mL組顯著低于對照組(P<0.05)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第9天，5、8、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)。

圖2 不同濃度的沒食子酸對豬精子頂體完整性的影響

3 討論與結(jié)論

豬精液常溫保存時(shí)目前養(yǎng)殖場使用做多的精液儲(chǔ)存方式，延長豬精液保存時(shí)間，不僅可以提高種公豬的利用率，也可以降低豬畜牧生產(chǎn)成本。精液稀釋劑中加入抗氧化劑是延長豬精液保存時(shí)間和提高保存精液質(zhì)量的有效方法，已有多種物質(zhì)被當(dāng)做抗氧化劑添加到稀釋液中用于精液保存。

觀察精液顏色、氣味是評(píng)估精質(zhì)量的第一步，利用CASA系統(tǒng)檢測精子的活率、活力、A+B級(jí)精子數(shù)以及利用試劑盒檢測精子的脂膜、頂體完整性是最常用的方法，精液的質(zhì)量與保存時(shí)間、方式、稀釋劑配方、操作方法、操作環(huán)境有關(guān)。研究表明，大部分抗氧化劑按適當(dāng)劑量加入精液稀釋劑都有利于提高精子活率、活力、運(yùn)動(dòng)方式和動(dòng)力學(xué)參數(shù)等，一些研究指出抗氧化劑加入精液稀釋劑可有效防止精子脂質(zhì)過氧化，影響精子活率以及保存時(shí)間。沒食子酸作為抗氧化劑，可以降低脂質(zhì)過氧化、提高抗氧化能力。目前為止，尚未有沒食子酸在豬精液常溫保存方面的研究，因此本實(shí)驗(yàn)在普通精液稀釋劑中加入不同濃度的GA，稀釋豬精液后17℃保存，發(fā)現(xiàn)GA可以不同程度的提高豬精子活率、A+B級(jí)精子數(shù)。精子質(zhì)膜和頂體完整是精子存活、受精的重要條件，本文研究了GA對豬精子質(zhì)膜和頂體完整的影響，結(jié)果表明沒食子酸可以提高精子質(zhì)膜和頂體完整，對于精子而言，低濃度的ROS是有益的，低濃度的ROS有利于通過生成cAMP和酪氨酸磷酸化來調(diào)控精子獲能 、精子頂體完整及精卵結(jié)合，但隨著保存時(shí)間的延長，精液中產(chǎn)生的ROS不能去除，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致過度的脂質(zhì)過氧化，破壞精子膜上的多不飽和脂肪酸與磷脂，造成精子的質(zhì)膜損傷，破壞頂體的完整性、DNA損傷和精子退化，有研究表明GA通過降低脂質(zhì)過氧化作用，增強(qiáng)抗氧化能力、降低DNA斷裂從而保護(hù)保護(hù)睪丸組織及減緩藥物致使的生殖機(jī)能損傷，此外，因GA能降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的能力，在黃牛卵母細(xì)胞體外成熟液中添加適量的沒食子酸能提高卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量及其胚胎發(fā)育能力，因此GA對豬精子活率、保存時(shí)間及膜完整性的影響可能是由于其抗氧化性。

綜上所述，精液稀釋劑中添加1-9 μg/mL沒食子酸可在保存第1-3天提高豬精液的精子活率、 A+B級(jí)精子數(shù)、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，7、9 μg/mL 沒食子酸在保存第3-9天提高豬精液的精子活率、 A+B級(jí)精子數(shù)、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。