5株凝結芽孢桿菌的鑒定及抗逆性分析

陳秀秀，孫洪浩，孫小涵，呂福軍

(遼寧波爾萊特農牧實業有限公司，遼寧 沈陽 110000)

隨著2019年禁抗令的頒布，飼料市場引起軒然大波，在動物疫病錯綜復雜，尤其是非洲豬瘟常態化的背景下，如何平穩地過渡到“無抗時代”，已成為畜牧全行業關注的焦點與挑戰。以生物技術為主導的畜牧生物產業正加速形成，并推動畜牧業高效快速的發展。微生物飼料添加劑被認為是抗生素的潛力替代物之一，具備改善生長性能、調節免疫反應和平衡腸道微生物菌群等作用。乳酸菌作為益生菌株應用于畜禽養殖歷史悠久，其中應用較多的為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌和雙岐桿菌等。酵母菌類因其可以產香的特點進而增加適口性，但此類制劑抗逆能力差，活菌存活率低，影響其飼喂效果。芽孢桿菌類益生菌因芽孢抗逆性強，可以直接添加至配合飼料中。因此，開發抗逆性強且對動物健康有益的菌種成為全國高度關注的重大課題。

凝結芽孢桿菌( Bacillus coagulans )為革蘭氏陽性兼性厭氧菌，非致病菌，產芽孢產乳酸的桿菌，端生芽孢，能夠分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等多種糖類產生L-乳酸，為同型乳酸發酵菌，最適生長溫度為40～50 ℃，最適生長pH 為6.6～7.0。凝結芽孢桿菌除具備普通乳酸菌的調節腸道內菌群平衡、促進營養物質代謝和提高免疫力的作用外，還具有耐膽鹽、耐胃腸消化液、熱穩定性等生物特性。本研究對5個凝結芽孢桿菌產品的抑菌性、耐消化液能力、耐膽鹽能力和熱穩定性進行評價，旨在為其飼料生產實踐篩選優良產品，為凝結芽孢桿菌作為飼用添加劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

凝結芽孢桿菌均購自國內不同廠家，分別命名為A、B、C、D、E；金黃色葡萄球菌(SA)、大腸埃希氏菌(K88)由本實驗室保存；MRS培養基、MRS肉湯、營養瓊脂、營養肉湯均購自北京陸橋技術股份有限公司；生化鑒定所用試劑購自青島海博生物科技有限公司；人工胃液和人工腸液購自北京雷根生物技術有限公司。

1.2 菌株分離鑒定

精確稱量1.000 g待測菌粉，置于100 mL稀釋液中， 37 ℃ 200 r/min充分振蕩30 min，； 80 ℃水浴20 min，梯度稀釋，MRS培養基傾注平板37 ℃培養48 h。挑取單菌落進行3次平板劃線純化菌株。

1.3 菌株生化鑒定

1.3.1 形態學觀察 取疑似單菌落進行革蘭氏染色、芽孢染色，觀察細菌形態及芽孢形成狀態。

1.3.2 生化鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》，對5株菌進行吲哚試驗、55 ℃生長、7%氯化鈉生長、檸檬酸鹽利用、V-P試驗、明膠液化、硝酸鹽還原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇發酵和溶菌酶生長等生化試驗。

1.4 總菌數測定

精確稱量1.0 g待測菌粉，置于100 mL稀釋液中， 37 ℃ 200 r/min振蕩30 min；再10倍逐級稀釋至所需稀釋度，MRS培養基傾注培養，37℃培養箱內厭氧培養48 h后計數。

1.5 熱穩定性試驗

取4個重復中的2個1 mL 10-2菌粉稀釋液作為實驗組，65 ℃、85 ℃、100 ℃水浴30 min，另外2個作為對照組不做處理。MRS培養基傾注培養，37 ℃培養48 h后計數，選取菌落數在30-300之間的平板進行計數，對照組不做處理，存活率計算公式如下：

存活率(%)=熱處理活菌數/對照組活菌數×100%

1.6 抑菌性試驗

精確稱量0.003 g(按30 g/t添加量)待測菌粉，置于100 mL MRS液體培養基中， 37 ℃ 200 r/min充分振蕩48 h，12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾備用。取活化后的指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌適量于LB液體培養基中，調整其吸光值約為0.05，測定600 nm處吸光度。實驗組為4 mL指示菌液加1 mL實驗菌液，對照組為4 mL指示菌液加1 mL生理鹽水。37 ℃ 200 r/min充分振蕩共培養3 h，測定600 nm處吸光度值，計算抑菌率。

抑菌率(%)=[(A空-A空0)-(A樣-A樣0)]/(A空-A空0)×100%

1.7 人工胃腸液耐受性試驗

精確稱量1.0 g待測菌粉加入pH 2.0人工胃液，37 ℃靜置培養4 h后，MRS培養基傾注培養。精確稱量1.000 g待測菌粉加入pH 7.6人工結腸液，37 ℃靜置培養12 h后，MRS培養基傾注培養，對照組為生理鹽水。

存活率(%)=胃腸液處理活菌數/對照組活菌數×100%

1.8 耐膽鹽試驗

取1 mL 10-2菌粉稀釋液，加入9 mL含有0.03%、0.1%、0.3%、0.5%、1%膽鹽濃度的MRS肉湯培養液中，對照組不做處理，37 ℃靜置培養24 h后， MRS培養基傾注培養， 37 ℃培養48 h后計數，選取菌落數在30-300之間的平板進行計數，計算存活率。

存活率(%)=膽鹽組處理活菌數/對照組活菌數×100%

1.9 數據分析

所有數據均用統計軟件SPSS 17.0進行統計學處理，數據均以平均值±標準差表示，參數組間比較采用 t 檢驗。

2 結果

2.1 分離菌株形態

A、D、E菌落為白色，呈圓形且邊緣整齊；B菌落灰白色，圓形，邊緣不整齊、中心突起且有光澤； C菌落扁平，呈白色，圓形，邊緣整齊且中心無凸起。5個菌株均為革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，芽孢端生，單個或成對，少數呈短鏈狀。

2.2 生理生化鑒定

由表1可知，菌株明膠液化陰性，V-P反應為陽性，55 ℃ 生長為陽性，吲哚試驗為陰性，7% 氯化鈉生長為陽性，溶菌酶生長為陰性，其他結果詳見表1。上述結果與《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》中關于凝結芽孢桿菌的分析進行比較，初步鑒定為凝結芽孢桿菌。

表1 各菌株生理生化特征

2.3 總菌數測定結果

為了考察不同廠家的凝結芽孢桿菌產品的菌量與所標注的是否一致，評價了5株凝結芽孢桿菌的總菌數，結果見表2。由表2可知，A、B、D、E的菌量均超出目標菌量，符合標準，而C的實際菌量比目標菌量少50億，E的實際菌量比目標菌量大約少一個數量級。

表2 各菌株的目標菌數測定

2.4 熱穩定性試驗

飼料生產過程中的某些環節如熱處理、制粒和膨化環節均需要高溫處理，溫度范圍一般在65～120 ℃之間，因此選擇65 ℃、85 ℃、100 ℃作為試驗溫度處理30 min，研究高溫對5株凝結芽孢桿菌存活率的影響。由圖1 可知，5株均完全耐受65 ℃，存活率均在100%左右；85 ℃處理后僅A株可達到100%，其余4株菌均有所下降；至100 ℃水浴30 min后，A株仍可達62%，具有良好的熱穩定性。

圖1 不同溫度對凝結芽孢桿菌存活率的影響

2.5 抑菌性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，比較5株凝結芽孢桿菌的抑菌活性，篩選出效果優的產品應用于臨床生產。根據表3結果顯示，A株對共培養的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性優于其他菌株，抑菌率分別是101.4%和99.8%，抑制大腸桿菌活性顯著高于B株(P<0.05)和E株(P<0.05)，同時也顯著高于D株(P<0.01)，抑制金黃色葡萄球菌活性顯著高于B株(P<0.05)和D株(P<0.05)，同時也顯著高于E株(P<0.01)。

表3 各菌株對指示菌的抑菌活性

同列無字母或數據肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，P<0.05和P<0.01是與A組相比。

2.6 人工胃腸液耐受性試驗

通常豬的胃酸pH值在2.0-3.0，進食后由于食物的中和作用pH可達5.0以上，流體食物在胃中停留時間為1-2 h，隨后進入小腸中，因此對人工胃腸液耐受性決定了益生菌在胃腸道中所能發揮的益生作用。根據表3的結果可知，A和C有較好的胃酸耐受性，在pH2.0的強酸條件下，存活率仍在50%以上。A株完全耐受人工腸液，存活率為100%，優于其他組凝結芽孢桿菌，其次是B株，存活率為95%。

2.7 耐膽鹽試驗

豬小腸正常膽鹽濃度范圍是0.03%～0.3%，選擇0.03%、0.10%、0.30%、0.50%和1.00%5個膽鹽濃度，比較不同凝結芽孢桿菌產品的耐膽鹽能力。圖2結果表明，A株和B株最大耐受膽鹽濃度為1%，存活率可達100%以上，在小腸環境中可以正常生長；其余三組都受到膽鹽的抑制作用，膽鹽濃度達到0.50%時，存活率明顯下降約20%～30%。

表4 人工胃腸液對凝結芽孢桿菌存活率的影響

圖2 不同膽鹽濃度對凝結芽孢桿菌存活率的影響

3 討論

凝結芽孢桿菌作為可以形成芽孢的益生乳酸菌，既具有芽孢桿菌的特點，同時還具有乳酸菌的優勢。研究表明凝結芽孢桿菌具有多種生物特性，例如抗菌、抗炎、調節腸道菌群平衡、改善機體免疫功能、促進消化吸收和改善仔豬腹瀉等。Sudha 等證實凝結芽孢桿菌IS2可以抑制炎癥因子IL-12、TN-α 和IFN-γ的表達，還能抑制環氧化酶COX-2的生成，從而抑制NF-κB P65 蛋白(Rel A)的表達。大量研究表明，凝結芽孢桿菌在腸道內生長代謝會分泌多種有益物質，如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、凝固素和Lactosporin等，這些酶類可以降解蛋白質、淀粉等大分子，增強腸道代謝率，進而提高飼料的利用率；多肽類抑菌物質凝固素是由 44 個氨基酸組成，呈現為一個α-螺旋連接兩個無規則卷曲的線性結構，能不受細胞膜限制而自由穿越，且不受淀粉酶、脂酶和有機溶劑的影響。細菌素Lactosporin可穿透致病菌表面，導致細胞內的氨基酸、無機鹽離子泄露，從而起到抑制病原菌的作用 。

凝結芽孢桿菌作為益生菌領域的研究熱點，除具有以上生物特性外，還具有耐熱和耐膽鹽等高抗逆性。本研究比較5個不同廠家的凝結芽孢桿菌產品的一些生理特性，通過對5株凝結芽孢桿菌的研究，結果顯示A和B菌株具有較好的高溫耐受性，在85 ℃條件下作用30 min，存活率可達到90%以上；菌種對細菌具備一定的抑菌能力，抑菌活性從高到低排序依次為A、C、D、E、B；A和C菌株具有較好的酸耐受性，用pH2.0人工胃液處理4 h，菌種存活率能達到50.0% 以上；5個菌株均可以耐受0.3%膽鹽，可以在小腸環境中正常生長。因此，可選擇抗逆性能最好的A株凝結芽孢桿菌作為備選飼料添加劑。隨著對凝結芽孢桿菌的進一步研究，凝結芽孢桿菌因其自身的特點和優勢，在飼料微生態制劑中發展應用潛力巨大，前景廣闊。今后將對凝結芽孢桿菌的益生性能做進一步的研究。