青海省大通縣犢牛糞樣中隱孢子蟲的鑒定及分子特征

李國平

(大通縣畜牧獸醫站,青海 大通,810100)

青海省大通縣是青海省西寧市下轄縣，地處青海東部河湟谷地，祁連山南麓，湟水河上游，是西寧地區水源之一，也是青藏高原和黃土高原的過渡地帶。大通縣屬高原大陸性氣候， 海拔 2 280～4 622 m，地勢西北高東南低。養殖畜禽種類為牛、羊、豬、禽等，近年來該縣畜牧業生產能力不斷增強，成為社會經濟發展新的增長點。

隱孢子蟲是重要的人獸共患腸道原蟲病，傳播范圍廣公共危害大，在環境中一般以卵囊/包囊形式存在，人和家畜感染后有 80%表現出持續腹瀉的臨床癥狀，其程度與機體的免疫狀態有關，免疫功能異常或免疫功能缺陷者往往表現為嚴重腹瀉，遷延難愈，常可造成動物死亡。由于缺乏相應的檢測手段和流行病學調查，長期以來獸醫對于隱孢子蟲一般都會當作細菌病進行治療，結果造成抗生素的濫用和大量耐藥菌株的產生。因此，開展動物源性隱孢子蟲病的調查、病原基因型的鑒定和分子特征研究，對于這種原蟲病的預防、公共衛生風險的評估以及追蹤感染源都具有重要的意義。

為了掌握青海省大通縣部分地區奶牛犢隱孢子蟲病的流行情況，采集 大通縣域地區200份奶牛犢糞樣用于隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測。所有樣品經蔗糖密度梯度離心法處理后用免疫熒光試驗(IFT)和巢式 PCR(nPCR)方法進行檢測，研究結果將為這種疾病的預防和控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣采集 2017 年 8～10 月，以青海省大通縣寶庫鄉和良教鄉奶牛養殖戶為調查對象， 采集奶牛犢(3-5 月齡)新鮮糞樣共計 200 份，其中寶庫鄉 178 份，良教鄉 22 份，分別編號為 QHDT2017001～QHDT2017200，每個采樣管按等比例分別加入 25 g/L 的重鉻酸鉀溶液， 送實驗室 4℃冰箱待檢。糞樣中的隱孢子蟲的卵囊/包囊采用文獻中推薦的蔗糖密度梯度離心法進行純化。

1.1.2 主要試劑與儀器 QIAGEN 糞樣 DNA 提取試劑盒、HotstarDNA 聚合酶等購自凱杰公司； PCR 產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、電泳緩沖液和 DNA 標準 DL2000 等試劑購自上海生工生物工程有限公司；隱孢子蟲熒光標記單克隆抗體檢測試劑盒購自Cellabs 公司；酵母提取物和胰蛋白胨為英國 OXOID 公司產品，其它化學試劑藥品均為國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光試驗(IFT) 將 200 份樣品純化后，每份取 25 μL 涂于載玻片上，用于隱孢子蟲卵囊和包囊的檢測。樣品涂勻后用甲醇固定，然后在樣品上滴加熒光素標記的抗隱孢子蟲單克隆抗體，樣品置于濕盒中并在 37℃溫箱孵育 30 min，之后用磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)沖洗 2 次，樣品上滴加 15μL甘油，用蓋玻片覆蓋后使用免疫熒光顯微鏡觀察卵囊/包囊的存在情況，通過隱孢子蟲大小、形狀、熒光等特征判定陰陽性結果。

1.2.2 樣品DNA 的提取 所有樣品經純化后采用 QIAGEN 糞樣DNA 提取試劑盒提取樣品DNA， 提取的DNA 保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 隱孢子蟲的PCR 擴增 參照文獻引物和方法對所有樣品采用 18S rRNA 基因擴增引物檢測隱孢子蟲的存在情況，擴增引物見表 1。PCR 產物純化后送蘇州金唯智生物技術有限公司采用 Sanger 法測序。測序結果與 GenBank 中的參考序列進行 BLSAT 比對分析，確定隱孢子蟲種屬；用 MegAlign 分析不同分離株和參考株之間序列的同源性，用 MEGA5.2 軟件中的鄰近法(NJ)構建系統發育樹，計算各序列之間的遺傳距離，確定隱孢子蟲的基因型。

表1 本研究中用于隱孢子蟲鑒定引物信息

2 結果

2.1 免疫熒光試驗結果

樣品與隱孢子蟲熒光單抗反應后，用熒光顯微鏡觀察涂片，共有 3 份樣品發現具有隱孢子蟲特征的卵囊(圖 1)，大小約為 4.5μm×5.0μm，判定為隱孢子蟲陽性。

圖1 免疫熒光抗體法檢測奶牛犢隱孢子蟲卵囊(1000×)

2.2 PCR鑒定結果

將純化的 200 份樣品分別采用基于隱孢子蟲 18S rRNA 基因引物的巢式 PCR 進行擴增，共有 2 份樣品擴增出了大小約為 500 bp 左右的條帶。PCR 產物測序后，經 BLAST 比對，結果均為隱孢子蟲序列。

2.3 系統發育樹分析

將隱孢子蟲 PCR 產物測序結果與 GenBank 中下載的其它相關序列用進行多序列比對，用 MEGA5.0 軟件構建遺傳進化樹，從遺傳凈化關系中可以看出本次檢測出的犢牛隱孢子蟲有 Cryptosporidium andersoni 和 Cryptosporidium bovis(圖 2)。

表2 奶牛犢糞樣間接免疫熒光和巢式 PCR 檢測結果

圖2 基于 18S rRNA 基因的隱孢子蟲遺傳進化分析

3 討論

隱孢子蟲是引起人和動物腹瀉的重要原因病原體，主要通過水源感染動物和人類。青海省大通縣位于湟水河上游，是西寧市水源地之一，因此檢測該地區動物及河流中的隱孢子蟲對于公共衛生學具有重要意義。在本次研究中通過巢式 PCR確定出隱孢子蟲在奶牛犢中的感染率為 1%，這可能與采集的糞樣大多數來自于健康犢牛以及犢牛的的年齡大于 2 月齡有關。之前 Wang GP 等采用 PCR方法研究青海省果洛地區犢牦牛腹瀉原因時發現，隱孢子蟲的感染率為 11.3%，該研究所有糞樣均采自有腹瀉癥狀和年齡小于 2 個月的犢牦牛。本研究采用 18SrRNA基因序列鑒定隱孢子蟲蟲種，結果表明大通縣寶庫鄉和良教鄉分離的蟲株分別為 C.andersoni和 C. bovis，這與之前青海、河南和黑龍江報道的牛源隱孢子蟲種基本一致。

本研究中采用 IFT顯微鏡檢查和巢式 PCR檢測了大通部分地區奶牛犢中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的流行情況，檢測結果表明調查動物中賈第鞭毛蟲的感染率高于隱孢子蟲的感染率，這也對該地區奶牛腹瀉病因的研究提供了重要的理論依據。由于在檢測方法上，每種方法都有自己的優缺點，所以本研究中采用了兩種方法平行檢測。從檢測結果可知，200份樣品中只有 3份樣品為隱孢子蟲陽性，其中 2份為巢式 PCR檢測陽性。不同檢測方法產生的結果差異可能是由于樣品中存在 PCR擴增抑制物，這種原因可能造成 PCR方法不能檢出。此外， 樣品 DNA濃度過低或模板 DNA分布不均勻以及 IFT的交叉反應現象也可能造成這種結果差異現象的發生。雖然 IFT方法在樣品檢測中比巢式 PCR敏感性強，但是 PCR方法特異性強，不會發生交叉反映，并且能夠確定分離蟲種的種屬及其基因型，因此，該方法目前廣泛應用各種病原體的鑒定及分子特征分析。另外，研究中還發現隱孢子蟲為陽性的犢牛都有不同程度的腹瀉癥狀，因此，有必要在該地區開展隱孢子蟲病的預防措施，以避免人和其它動物的進一步感染。