適用于生物人工肝的3種不同肝細胞的增殖能力及代謝功能的比較研究

李建州 李曉青 楊 英 李蘭娟

肝衰竭病情危重，病死率高，常規(guī)內科治療效果很不理想[1,2]。人工肝支持系統(tǒng)是目前臨床治療肝衰竭的最重要手段之一，而以培養(yǎng)肝細胞為基礎的生物人工肝(bioartificial liver，BAL)由于結構和功能更接近正常肝臟，完全替代肝臟的合成、代謝解毒等功能，成為近年來研究的熱點，有望為肝衰竭的臨床治療提供新的途徑[3,4]。

目前國外已有多個BAL系統(tǒng)進入臨床試驗階段，但達到真正的大規(guī)模臨床應用仍有很多問題需要解決，其中最關鍵的是如何獲得足夠數(shù)量、高活性且功能良好的肝細胞[5,6]。本研究以Huh7細胞、永生化人源性HepLi3細胞為研究對象，以C3A細胞為對照，比較3種細胞的增殖能力及合成、代謝功能，評估其作為生物人工肝細胞源的潛力。

材料與方法

1.細胞系及主要試劑：C3A細胞系和Huh7細胞系購自美國標準生物品收藏中心；HepLi3細胞系由傳染病國家重點實驗室建立并提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國英杰生命技術有限公司；MTT試劑盒購自瑞士Roche公司；白蛋白檢測試劑盒購自美國Bethyl Laboratories公司；尿素檢測試劑盒購自美國BioAssay System公司；CYP3A4檢測試劑盒、CYP1A2檢測試劑盒購自美國Promega公司；Trizol試劑購自美國英杰生命技術有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa生物株式會社；CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4一抗抗體購自上海艾博抗貿易有限公司；熒光二抗購自美國R&D Systems公司。

2.細胞培養(yǎng)及生長曲線實驗：3種肝細胞均用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將3種細胞以每孔2000個細胞接種于96孔板上，各設置3個副孔，分別在第0、24、48、72h進行MTT檢測。在各孔加入10μl的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4h，加入溶解液后孵育過夜，用酶聯(lián)檢測儀檢測595nm波長下的吸光度值，繪制生長曲線。

3.熒光定量PCR分析：在同樣的培養(yǎng)條件下，用胰酶消化細胞，離心獲取細胞，采用Trizol法提取3種肝細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，應用ABI7500熒光定量PCR儀進行反應，數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進行分析。PCR引物詳見表1。

表1 PCR引物序列

4.免疫熒光蛋白分析：用4%的多聚甲醛室溫固定細胞20min，PBS洗滌后用0.25% TritonX-100室溫處理細胞30min，PBS洗滌后用2.5% BSA封閉1h，稀釋的一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌后用稀釋的二抗避光孵育60min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下拍照，目標蛋白顯示為胞質的綠色熒光，細胞核為紅色熒光，用Image J軟件進行熒光吸光度分析。

5.肝細胞合成與代謝功能的檢測：將3種細胞接種于12孔板上，設置3個復孔，適應性培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，留取上清按試劑盒說明書分別進行白蛋白、尿素含量的檢測。按試劑盒說明書采用熒光底物法分別進行CYP1A2、CYP3A4代謝活性的檢測，最終結果以培養(yǎng)孔細胞總蛋白標準化。

6.肝衰竭血漿對3種肝細胞活性的影響：取筆者醫(yī)院住院乙肝相關慢加急性肝衰竭患者血漿置換時分離的血漿(相關檢測指標如下：總膽紅素388μmol/L，直接膽紅素膽紅素320μmol/L，凝血酶原活動度25%，血氨106μmol/L，HBV-DNA 3.85E+007IU/ml)，將3種細胞以每孔2000個細胞接種于96孔板上，各設置3個副孔，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基為肝衰竭血漿，以正常培養(yǎng)基為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用MTT法檢測細胞活性。

結 果

1.3種肝細胞的形態(tài)及生長曲線：3種肝細胞形態(tài)雖略有不同，但均呈多邊形或不規(guī)則形，邊界清楚，細胞核較大，核膜清楚，胞質豐富，與正常肝細胞類似。3種肝細胞均具有良好的增殖能力，生長曲線均呈S型，24～48h開始進入對數(shù)生長期。在24h后，HepLi3細胞的增殖能力明顯強于C3A細胞和Huh7細胞(P<0.05，圖1)。

圖1 3種肝細胞的形態(tài)(×200)及生長曲線A.C3A細胞；B.Huh7細胞；C.HepLi3細胞；D.3種肝細胞的生長曲線;與C3A細胞比較，*P<0.05；與Huh7細胞比較，#P<0.05

2.3種肝細胞的功能基因mRNA的表達：在mRNA表達層面，3種肝細胞比較，C3A細胞CYP2E1的表達水平最高(P<0.05)；Huh7細胞GST、CYP1A2、CYP3A4的表達水平最高，ALB的表達水平最低(P<0.05)；HepLi3細胞ALB、GST的表達水平與C3A細胞相當，但CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4的表達水平最低(P<0.05，圖2)。

圖2 3種肝細胞功能基因mRNA的表達水平與C3A細胞比較，*P<0.05；與Huh7細胞比較，#P<0.05

3.3種肝細胞代謝功能基因蛋白的表達：在蛋白表達層面，3種肝細胞比較，C3A細胞CYP2E1的表達水平最高(P<0.05)；Huh7細胞CYP3A4的表達水平最高。HepLi3細胞CYP2E1、CYP3A4的表達水平與C3A細胞相當；3種肝細胞CYP1A2的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 3種肝細胞功能基因蛋白的表達水平A.免疫熒光染色圖(×200)，目標蛋白顯示為胞質綠色熒光，細胞核紅色熒光；B.相對熒光強度值的比較；與C3A細胞比較，*P<0.05；與Huh7細胞比較，#P<0.05

4.3種肝細胞的合成及代謝功能的比較：3種肝細胞比較，C3A細胞白蛋白合成功能最強(P<0.05)；Huh7細胞的CYP1A2代謝活性最高；HepLi3細胞的CYP3A4代謝活性最高(P>0.05)；3種肝細胞尿素的合成功能比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。

圖4 3種肝細胞的合成及代謝能力的比較A.白蛋白合成功能；B.尿素合成功能；C.CYP1A2代謝活性；D.CYP3A4代謝活性；與C3A細胞比較，*P<0.05；與Huh7細胞比較，#P<0.05

5.肝衰竭血漿對3種肝細胞活性的影響：在培養(yǎng)24h后，與培養(yǎng)基組比較，肝衰竭血漿組肝細胞的活性無明顯下降(P>0.05，圖5)。

圖5 肝衰竭血漿對3種肝細胞活性的影響

討 論

BAL發(fā)揮治療作用主要依賴于反應器中的肝細胞，肝細胞源是目前制約BAL研發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)。理想的肝細胞源應具有以下特點：①易于獲取且能夠體外培養(yǎng)條件下擴增；②具有良好的正常人肝細胞生理功能；③具有良好的生物安全性。理論上，正常人原代肝細胞生理功能及安全性最好，但是肝臟來源短缺及原代肝細胞無法長期體外培養(yǎng)及增殖限制了其臨床應用。為了尋找易于擴增的高活性、功能良好的肝細胞源，國內外研究者進行了積極的探索，其中以人肝腫瘤源性C3A細胞研究最多，該細胞不僅具有較好的增殖能力，而且能夠較好地保持肝細胞合成及代謝、解毒功能[7～13]。以該細胞為基礎的體外肝臟支持系統(tǒng)(extracorporeal liver assist device，ELAD)經過多年的研發(fā)，已在歐美多個國家開展三期臨床試驗，是目前最成功的BAL系統(tǒng)[14,15]。本研究選用的Huh7細胞也是一種人肝腫瘤源性細胞，目前在BAL研究中尚未見報道。李蘭娟團隊前期應用SV40大T抗原基因的反轉錄病毒感染原代人肝細胞，成功構建了多株永生化人源性肝細胞系，既保持了人肝細胞的生物特性和功能，且增殖能力強，為BAL提供了更多的細胞源選擇[16]。本研究選用的HepLi3細胞為其中的一株細胞系。

本研究通過比較發(fā)現(xiàn)，3種肝細胞在常規(guī)的培養(yǎng)條件下均具有良好的增殖能力，72h能夠擴增3～4倍。其中HepLi3的增殖能力優(yōu)于C3A細胞、Huh7細胞，更加適合大規(guī)模培養(yǎng)，在短時間內為BAL治療提供足夠數(shù)量的肝細胞。在功能基因的表達上，本研究從mRNA、蛋白表達兩個層面進行檢測，結果顯示白蛋白合成及多種細胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)家族相關基因在3種肝細胞中均有一定程度的表達。雖然部分基因的表達差異與功能的差異并不完全一致，但也在一定層面體現(xiàn)了3種細胞部分保持了肝細胞原有的生物學特性。在功能評估上，本研究發(fā)現(xiàn)C3A細胞的白蛋白合成能力最好，這與既往的研究報道一致。而Huh7細胞的CYP1A2代謝活性最高，HepLi3細胞的CYP3A4代謝活性最高。

CYP450是主要分布于肝微粒體的藥物主要代謝酶，參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內源性物質及藥物、毒物、致癌物等外源性化合物的代謝，與肝臟的代謝解毒功能密切相關[17,18]。在臨床治療上，BAL的合成功能可以通過外源性補充白蛋白、血漿等來解決，代謝解毒功能才是BAL發(fā)揮作用的關鍵。本研究通過多個層面的評估發(fā)現(xiàn)，Huh7細胞、HepLi3細胞在代謝解毒方面相較于C3A細胞可能更具優(yōu)勢，但還需要進一步系統(tǒng)全面的評估。

肝衰竭患者體內存在大量毒性物質積聚，可能會在BAL治療過程對反應器中肝細胞活性產生不利影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝衰竭血漿中培養(yǎng)24h后，3種肝細胞的活性均沒有顯著下降，為其功能發(fā)揮提供的基本保證。綜上所述，Huh7細胞、HepLi3細胞具有良好的增殖能力及合成、代謝功能，有望為BAL提供良好的細胞源。