左側星狀神經節切除對慢性心力衰竭心功能的影響

顏 輝 吳 鋼 王 樂 王 順 毛 帥 江 洪 黃從新

慢性心力衰竭是多種原因導致心肌射血能力和(或)心室充盈功能下降的臨床綜合征，也是大多數心臟疾病發生、發展的終末階段[1]。慢性心力衰竭的主要病理特征之一是自主神經失平衡，包括交感神經系統功能亢進和迷走神經功能減弱。交感神經的過度激活會促使心肌細胞凋亡增加和炎性反應持續產生[2]。抑制交感神經的活性是治療慢性心力衰竭的重要手段。星狀神經節是心臟交感神經支配的重要成分。2012年Concei?o-Souza等[3]進行的一項前瞻性隨機試驗，初步證明左側星狀神經節切除治療收縮性心力衰竭是安全的和有效的。本研究旨在探索左側星狀神經節切除對慢性心力衰竭心功能的影響及其機制，為臨床治療慢性心力衰竭提供依據。

材料與方法

1.實驗動物：本研究中的所有動物程序均經武漢大學人民醫院實驗動物福利倫理審查委員會批準，由武漢大學人民醫院動物中心提供實驗動物(動物合格證編號：00270753)。動物使用過程嚴格按照北京大學制定的《動物保護與使用指南》執行。由武漢大學人民醫院動物中心提供SPF級雄性大鼠24只，8周齡，平均體質量為200～250g。采用數字表法隨機分為3組，即對照組(腹主動脈縮窄術，n=8)、LSG組(左側星狀神經節切除+腹主動脈縮窄術,n=8)和假手術組(左側星狀神經節切除假手術+腹主動脈縮窄術，n=8)。

2.試劑與儀器：無水乙醇、二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精染液、伊紅染液購自美國Aspen公司；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自英國Abcam公司；caspase-3、caspase-9抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；脫水機、包埋機、凍臺、組織攤片機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；小動物手術器械購自新華手術器械有限公司。

3.構建壓力超負荷心力衰竭模型：大鼠在動物中心適應環境1周后，3組大鼠均行腹主動脈縮窄術心力衰竭模型造模。取仰臥位固定，腹腔內注射50mg/kg戊巴比妥鈉麻醉成功后，在腹中段沿腹正中線做約2cm切口，鈍性分離暴露腹主動脈，以22G號針頭結扎，取出針頭，制造約0.7mm直徑的殘腔，逐層縫合關閉切口，術后2天大鼠逐漸出現呼吸和心跳加速、畏寒倦怠和食欲減退等癥狀，提示手術造模成功。

4.左側星狀神經節切除：LSG組大鼠在完成腹主動脈縮窄術后進行左側星狀神經節切除手術。大鼠取仰臥位固定，沿頸部正中做1cm長切口，鈍性分離后，顯微鏡下找到頸上神經節，距其下端3mm處離斷星狀神經節，斷端結扎，縫合切口。術后5min內出現左側眼球內陷、瞳孔縮小及上瞼下垂等表現提示手術成功。假手術組僅進行左側星狀神經節分離，不予切除，逐層縫合，關閉切口。腹主動脈縮窄術后繼續喂養10周。

5.超聲心動圖檢測：腹主動脈縮窄術后10周行超聲心電圖檢測，在二維超聲引導下，探頭在胸骨旁左心室長軸切面掃描，采集M型超聲心動圖，測量室間隔厚度(intra-ventricular septum diastole, IVSD)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall diameter, IVPWD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)、左心室舒張末期容積 (left ventricular end diastolic volume, LVEDV)，取測量的3個心動周期的平均值，并按照Teichholt 公式計算出左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室縮短分數(left ventricular fraction shortening, LVFS)，評估大鼠心腔大小和射血功能。

6.心臟組織HE染色：大鼠處死后，立刻用眼科小剪刀剪取大鼠心尖部約5mm×5mm×5mm心肌組織，制備石蠟切片，各組隨機選取3張切片，然后進行HE染色，在光學顯微鏡(×400)下觀察心肌組織的形態結構和病理改變(心肌細胞形態、結構，心肌纖維排列，炎性細胞浸潤)。

7.酶聯免疫吸附測定檢測心肌炎性細胞因子TNF-α和IL-6水平：獲取心肌組織，組織勻漿，稀釋待測樣品和標準品至合適濃度，按100微升/孔加入到酶標板中，4℃過夜。TNF-α和IL-6抗體用稀釋液，加入100微升/孔，在37℃環境下放置到濕盒45min。然后洗板3次。加入親和素過氧化物酶復合物工作液100μl，在37℃環境下反應30min，依次加入TMB顯色液，37℃避光反應30min，最后加入50μl終止液，用ELISA檢測儀于450nm波長處測定吸光度值。

8.蛋白印跡檢測心肌組織凋亡蛋白caspase-3和caspase-9蛋白的表達：獲取心肌組織，蛋白提取試劑盒收集細胞蛋白，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉膜。4℃環境下加入1∶100到1∶500稀釋兔抗大鼠caspase-3、caspase-9多克隆抗體孵育過夜，加入1∶1000稀釋HRP標記羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30min，顯色系統中顯色定影，分析雜交條帶。

結 果

1.各組超聲心動圖心功能指標比較：各組超聲心動圖心功能指標IVSD、LVPWD、LVEDd、LVEDV、LVEF、LVFS比較，經方差分析，差異有統計學意義(P<0.05)。LSG組IVSD、IVPWD較對照組和假手術組低(P均<0.05),LVEDd、LVEDV較對照組和假手術組低(P均<0.05)，LVEF、LVFS較對照組和假手術組高(P均<0.05)。對照組和假手術組比較，心功能指標差異無統計學意義(P>0.05，圖1，表1)。

表1 術后10周各組大鼠心功能的比較

圖1 術后10周各組大鼠超聲心動圖結果A.對照組;B.LSG組;C.假手術組

2.各組心肌肥厚程度比較:各組HE染色結果顯示，LSG組心肌細胞排列較規則整齊，而對照組和假手術組的心肌細胞空泡化，細胞間隙明顯，部分細胞溶解(圖2)。

圖2 術后10周各組大鼠心肌HE染色結果(×400)A.對照組;B.LSG組;C.假手術組

3.各組心肌組織炎性細胞因子TNF-α和IL-6水平比較：LSG組炎性細胞因子明顯低于對照組和假手術組，這說明LSG可以顯著改善慢性心力衰竭的心臟炎性水平(表2)。

表2 術后10周各組大鼠心肌炎性細胞因子TNF-α、IL-6比較

4.各組心肌組織凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表達量比較：LSG組細胞凋亡蛋白表達低于對照組和假手術組，這說明在心力衰竭第10周時，LSG可以明顯減少慢性心力衰竭心肌細胞凋亡(圖3)。

圖3 術后10周各組大鼠心肌組織caspase-3和caspase-9表達

討 論

本研究建立腹主動脈縮窄術后慢性心力衰竭大鼠模型，行左側星狀神經節切除手術，觀察其對慢性心力衰竭大鼠心功能的影響。本研究的實驗結果是腹主動脈縮窄術后10周，LSG組炎性細胞因子TNF-α、IL-6水平明顯下降,凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表達水平顯著降低，心功能明顯好轉。

慢性心力衰竭是一種進展性病程，從代償性心肌肥厚逐漸發展到心室重構及心肌纖維化，最終走入失代償性終末期階段[4,5]。眾所周知，抑制交感神經的活性是治療慢性心力衰竭的重要手段，比如藥物治療β受體阻滯劑。長期服用β受體阻滯劑可以明顯改善慢性心力衰竭嚴重程度和提高慢性心力衰竭患者的生活質量。交感神經節切除是抑制交感神經活性的重要方法，主要用于遺傳性室性心律失常如長QT綜合征和環肺靜脈消融的治療。既往研究證實，左側心臟交感神經去神經可減輕長QT綜合征和兒茶酚胺能多形性室性心動過速患者的室性心律失常發作，也可能對治療其他通道病和心肌病患者有利[6,7]。雙側心臟交感神經去神經支配可以降低室性心動過速或心室顫動的誘發性，并減輕交感神經激活對梗死心臟復極的影響[8]。

心臟交感神經節切除用于慢性心力衰竭治療尚在探索之中。星狀神經節由第1胸神經節與頸下神經節融合而成，是心臟交感神經支配的重要通路。多項研究表明，星狀神經節干預治療心力衰竭是可行的及有效的。即使全部切除左側星狀神經節后，右側交感神經輸出仍然存在[9]。鄭建濱等[10]研究顯示，腹主動脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型后，以0.1%利多卡因阻滯右側星狀神經節持續2周，與對照組和假手術組比較，星狀神經節阻滯組大鼠的TNF-α、IL-1β水平較低，PI3K、Akt蛋白相對表達量較高,caspase-3蛋白相對表達量較低，高倍鏡視野下TUNEL染色平均陽性數較少。Zhang等[11,12]研究慢性心力衰竭大鼠時發現，雙側星狀神經節切除可以通過下調交感神經激素的表達，使得纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原纖維等心肌纖維化標志物明顯減少，進而減輕心肌肥厚，改善心功能。這說明雙側星狀神經節切除可以減輕慢性心力衰竭的心室重構和心肌纖維化水平。最近的另外一項研究顯示，在星狀神經節切除后10周，左側、右側星狀神經節切除組較對照組Ⅰ型膠原纖維，以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的比值低(P=0.000)，慢性心力衰竭大鼠心功能明顯好轉[13]。

既往研究發現，心力衰竭和炎癥密切相關。炎性反應已被證實參與慢性心力衰竭整個演變過程[14]。炎性細胞因子可以誘發心肌肥厚、心肌纖維化、左心室功能障礙和細胞凋亡[15]。炎性細胞因子如TNF-α、IL-6和慢性心力衰竭嚴重程度呈正相關[16]。通過抑制炎性反應來改善心臟功能已被廣泛討論并研究。最新有研究報道稱交感神經系統可以調控心臟局部炎癥。在心力衰竭中晚期階段，隨著交感神經系統興奮性持續增高，交感神經和腎素-血管緊張素-醛固酮系統過度激活可能促使心力衰竭產生持續性的炎性反應[2]。在壓力超負荷時，交感神經系統的激活會通過p53信號通路上調細胞間黏附分子-1和整合素表達，加重心功能障礙，從而促進心臟炎性反應[17]。有研究者提出，通過抑制過度興奮的交感神經功能抑制炎性細胞因子的表達和細胞凋亡是可行的。本研究的實驗結果與既往研究結果一致，LSG組TNF-α、IL-6水平明顯下降，這說明左側星狀神經節切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心臟炎癥。

隨著心力衰竭機制研究的不斷深入，人們發現細胞凋亡與心力衰竭關系密切。近年來國內研究表明，星狀神經節阻滯能夠通過增強 PI3K/Akt 信號通路，降低凋亡相關基因蛋白的表達和心肌細胞凋亡指數，從而減輕左心室肥厚并改善心功能[18]。星狀神經節切除是否同樣具有抑制心肌細胞凋亡來改善心力衰竭心功能的作用，目前暫沒有相關研究報道。本研究發現，腹主動脈縮窄術后10周，LSG組凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表達水平顯著降低。本研究證實了左側星狀神經節切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌細胞凋亡。

本研究存在的不足：①未進行細胞層面及相關的信號通路研究；②未進行臨床實驗來驗證左側星狀神經節切除對慢性心力衰竭治療效果；③本研究缺乏左側星狀神經節切除與臨床一線藥物如β受體阻滯劑的對比研究。

綜上所述，本研究表明，左側星狀神經節切除通過抑制心臟炎癥和心肌細胞凋亡明顯改善慢性心力衰竭大鼠心功能。