二甲雙胍增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療敏感度的分子機(jī)制研究

金鵬程 林 杰 朱鵬磊 王歐洋 吳 昊 童凌云

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，也是致死率最高的腫瘤[1]。既往研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)主要的免疫細(xì)胞從而限制了其抗原遞呈過(guò)程，而最新研究表明腦組織內(nèi)存在活躍的免疫監(jiān)視和免疫響應(yīng)機(jī)制[2,3]。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中程序性細(xì)胞死亡配體1(PD-L1)表達(dá)水平升高，主要組織相容性復(fù)合物表達(dá)降低，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量抗炎因子，具有腫瘤免疫抑制特征[4]。研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中PD-L1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)放化療后復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤組織具有更強(qiáng)的免疫原性[4～6]。

替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一種具有抗腫瘤活性的烷化劑，是膠質(zhì)瘤治療的一線化療用藥。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)TMZ治療后組織PD-1表達(dá)顯著升高[7]。另一項(xiàng)更大樣本量的臨床研究則發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)水平與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)[5]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TMZ處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞強(qiáng)烈抑制外周單核細(xì)胞的激活和促炎性因子的表達(dá)，同時(shí)TMZ促進(jìn)PD-L1表達(dá)。將PD-1抑制劑與TMZ聯(lián)用可以顯著增加腫瘤組織T細(xì)胞浸潤(rùn)，改善T細(xì)胞耗竭，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤化療敏感度[8～10]。

二甲雙胍是一個(gè)代謝調(diào)控藥物，由于其臨床應(yīng)用成熟、成本低廉，研究者利用其與各種治療方式開(kāi)展聯(lián)合治療，以尋求更優(yōu)的治療策略。二甲雙胍可通過(guò)mTOR通路抑制HIF-1α表達(dá)，通過(guò)HIF-1α/PFKFB3/PFK1途徑降低糖酵解活性從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，還可通過(guò)HIF-1α/PKM2通路抑制成纖維細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11, 12]。有研究表明二甲雙胍可改善低氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度[13]。本研究探討了如何提升膠質(zhì)瘤現(xiàn)有治療藥物敏感度，為尋找新的有效干預(yù)策略提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。含10% FBS的MEM完全培養(yǎng)基37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，每3天傳代1次。

2.藥物處理：二甲雙胍處理濃度為10mmol/L，mTOR激動(dòng)劑MHY1485處理濃度為2μmol/L，TMZ處理濃度為0.1mmol/L，處理時(shí)長(zhǎng)為48h。

3.Western blot法：RIPA緩沖液(Beyotime)冰上裂解U87MG，然后BCA方法測(cè)量總蛋白濃度。20μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10% SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜。通過(guò)與5% BSA在室溫下孵育阻斷非特異性結(jié)合。然后將膜與一抗(1∶1000)在4℃孵育過(guò)夜。使用的一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology生物公司：HIF-1α(#36169)，HK2(#2867)，PKM2(#4053)，PFKFB3(#13123)，PD-L1(#13684)，mTOR(#2983)，p-mTOR(#5536)。次日將膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Beyotime公司)檢測(cè)免疫印跡信號(hào)。

4.qRT-PCR：使用Trizol(日本TaKaRa公司)從U87MG中提取總RNA。使用Nanodrop(美國(guó)Thermo Scientific公司)在260和280nm的波長(zhǎng)處讀取樣品吸光度，測(cè)定RNA的完整性和濃度。緊接著利用cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)合成cDNA。引物序列詳見(jiàn)表1。使用2-ΔΔct方法評(píng)估基因的相對(duì)表達(dá)。使用美國(guó)ABI StepOne實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR。

表1 相關(guān)引物序列

5.細(xì)胞免疫熒光：將U87MG接種于24孔板。4%多聚甲醛固定U87MG，用1PBS溶液(+0.1% Triton X-100)通透，抗山羊血清封閉，緊接著HIF-1α一抗 (1∶150) 4℃孵育過(guò)夜。次日，相應(yīng)的熒光二抗 (1∶200) 水平搖床孵育2h，DAPI (1∶1000) 避光染核。最后于熒光顯微鏡下觀察。

6.葡萄糖消耗量和乳酸釋放量：葡萄糖消耗檢測(cè)采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒，乳酸釋放量檢測(cè)采用乳酸檢測(cè)試盒，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。U87MG經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)處理后，收集上清，加入相應(yīng)試劑。自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定505nm波長(zhǎng)的吸光度葡萄糖消耗量；測(cè)定530nm波長(zhǎng)的吸光度乳酸釋放量。

7.Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集U87MG，凋亡試劑盒(美國(guó)B D公司)處理細(xì)胞，注意避光。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U87MG細(xì)胞凋亡率，采用FACSDiva 6.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

8.CCK8測(cè)定IC50：經(jīng)過(guò)二甲雙胍或MHY1485處理后，將U87MG接種到 96 孔板。加入TMZ，恒溫培養(yǎng)48h。加入CCK8工作液，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm 波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算各組U87MG的生長(zhǎng)抑制率。采用GraphPad Prism 8.0分析軟件計(jì)算 IC50值，進(jìn)而反映U87MG對(duì)TMZ的藥物敏感度。

結(jié) 果

1.替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響：本研究將U87MG用TMZ(0.1mmol/L)處理0、24、48、72h，HIF-1α表達(dá)隨著TMZ處理時(shí)間增加而升高(圖1A和圖1B)，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，48h后HIF-1α核內(nèi)水平顯著升高(圖1C)。

圖1 TMZ影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF-1α表達(dá)A.Western blot法;B.qRT-PCR；C.TMZ不同處理時(shí)間下，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HIF-1α;與0h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

2.HIF-1α表達(dá)抑制對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解活性以及PD-L1的影響：在U87MG中下調(diào)HIF-1α表達(dá)，發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶HK2、PKM2、PFKFB3表達(dá)下調(diào)，并且葡萄糖消耗量和乳酸釋放量均顯著降低，糖酵解活性降低(圖2)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HIF-1α表達(dá)使得糖酵解活性降低，PD-L1表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生。

圖2 下調(diào)HIF-1α表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解活性以及PD-L1表達(dá)A.檢測(cè)siHIF-1α干擾效果; B.葡萄糖消耗量; C.乳酸釋放量; D.Western blot法檢測(cè)糖酵解關(guān)鍵酶和PD-L1表達(dá); E.qRT-PCR；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

3.替莫唑胺聯(lián)合二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用：TMZ聯(lián)合二甲雙胍(10mmol/L)處理U87MG細(xì)胞株，結(jié)果表明，與TMZ誘導(dǎo)組比較，TMZ+二甲雙胍組HIF-1α表達(dá)下調(diào)，但均比對(duì)照組表達(dá)高(圖3A～C)。測(cè)定糖酵解活性發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組糖酵解活性降低，糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)顯著下調(diào)(圖3B和圖3C)，同時(shí)葡萄糖消耗量和乳酸釋放量降低(圖3D和圖3E)。Western blot法和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明聯(lián)合處理組PD-L1蛋白表達(dá)下調(diào)(圖3B和圖3C)。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明聯(lián)合處理組凋亡率升高(圖3F)。CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ化療敏感度的影響。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)反映細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度。結(jié)果顯示TMZ+二甲雙胍組IC50減小(圖3G)。

圖3 TMZ聯(lián)合二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用A.細(xì)胞免疫熒光;B.Western blot法;C.qRT-PCR;D.葡萄糖消耗量;E.乳酸釋放量;F.Annexin V-FITC/PI染色;G.CCK8檢測(cè)IC50;與以不做任何處理的U87MG為對(duì)照組比較，*P<0.01，**P=0.000; 與以僅用TMZ處理為對(duì)照組比較，**P=0.000

4.mTOR激動(dòng)劑減弱二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺化療敏感度的增強(qiáng)作用：Western blot法和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與TMZ誘導(dǎo)組比較，TMZ誘導(dǎo)+二甲雙胍組mTOR磷酸化水平降低，HIF-1α表達(dá)下調(diào)，并且PD-L1表達(dá)顯著降低(圖4A和圖4B)。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMZ化療敏感度(圖4C)，發(fā)現(xiàn)MHY1485處理后，IC50值一定程度變大。

圖4 MHY1485對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響A.Western blot法;B.qRT-PCR;C.CCK8檢測(cè)IC50;**P<0.01，***P=0.000

討 論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境的代謝重構(gòu)是影響膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫治療效果的關(guān)鍵因素[14]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞主要以糖酵解方式快速獲取能量，同時(shí)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。在腫瘤微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞消耗大量葡萄糖和氧氣，造成局部缺氧，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白生成，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞活性并激活免疫抑制性CD4+T細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制微環(huán)境；代謝產(chǎn)物乳酸的堆積促使單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，通過(guò)分泌免疫抑制因子、抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答而直接抑制免疫反應(yīng)[15]。本研究聯(lián)合二甲雙胍與TMZ作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，同時(shí)研究其作用機(jī)制。

本研究用TMZ處理U87MG，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)升高，同時(shí)48h后HIF-1α在核內(nèi)水平顯著升高。有研究報(bào)道，TMZ處理原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)HIF-1α水平升高并大量入核[16]。與本研究結(jié)果一致。下調(diào)U87MG中HIF-1α表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)糖酵解活性降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)顯著下調(diào)。Palsson-McDermott等[17]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶PKM2能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性從而促進(jìn)PD-L1的表達(dá)。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)了PFKFB3通過(guò)NF-κB依賴的途徑促進(jìn)PD-L1表達(dá)。以上研究表明，TMZ能夠升高HIF-1α在核內(nèi)水平，進(jìn)而增強(qiáng)糖酵解活性，促進(jìn)PD-L1表達(dá)。

TMZ雖然是膠質(zhì)瘤治療的一線化療用藥，但是上調(diào)了PD-L1表達(dá)，促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)，因此TMZ敏感度是膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵因素[8,9]。二甲雙胍能夠抑制HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而降低糖酵解活性從而抑制細(xì)胞增殖，而且多篇研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可改善低氧狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感度[13,19，20]。但是，二甲雙胍的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究將TMZ聯(lián)合二甲雙胍處理U87MG，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)下調(diào)，糖酵解活性降低，PD-L1蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生。同時(shí)細(xì)胞凋亡被促進(jìn)，替莫唑胺IC50值變小，說(shuō)明二甲雙胍能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mTOR激動(dòng)劑能夠減弱二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ化療敏感度的增強(qiáng)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感度，同時(shí)闡明了其作用機(jī)制，為提升膠質(zhì)瘤現(xiàn)有治療藥物敏感度、尋找新的有效干預(yù)策略提供了科學(xué)依據(jù)。