腺苷酸琥珀酸合成酶2對肝癌細胞遷移作用的研究

成 睿 趙 琴 蔣玉輝

肝癌是最常見的腫瘤之一，其發生率位于全球第6位，并且在腫瘤相關的死亡中排名第4位[1]。肝癌是一個病因復雜的疾病，而乙型肝炎-肝硬化-肝癌是最常見的肝癌發展進程之一[2，3]。我國作為一個乙型肝炎大國，肝癌的發生率日益增高，且大多數患者就診時已處于晚期階段，目前我國肝癌的5年生存率僅為12.1%[4～6]。因此闡明肝癌發生的分子機制并確定有效的分子靶標對于肝癌的早期診斷及治療具有重要意義。

嘌呤核苷酸是生命活動所必須的有機低分子，它不僅是DNA及RNA的基本成分，還是體內重要的能量來源，它的合成途徑分為從頭合成及補救途徑兩種方式[6]。越來越多的證據表明在癌變的過程中存在嘌呤核苷酸的代謝失衡，且其合成與分解的代謝異常與腫瘤發生、發展密切相關[7～9]。肝臟作為嘌呤核苷酸最主要的合成器官，為人體的正常生命活動提供了充足的原料。而在肝癌發生時，合成嘌呤核苷酸的代謝酶異常活躍，腺苷酸琥珀酸合成酶作為嘌呤從頭合成的關鍵酶，參與了IMP向ATP轉化的第1個步驟，而腺苷酸琥珀酸合成酶2(adenylosuccinate synthase isozyme 2，ADSS)是其在肝臟中的存在形式，在腫瘤發生時異常表達，而其在腫瘤發生、發展中的功能至今未能闡明[10]。

本研究在對公共數據庫探索的基礎上，利用肝癌細胞探索ADSS在肝癌中的表達及其在肝癌發生、發展中的作用，為其作為肝癌早期診斷及治療靶點提供依據。

材料與方法

1.實驗材料：(1)細胞株：人肝臟細胞株LO2、人肝癌細胞株HepG2、Huh7和Hep3B購自ATCC細胞庫，人肝癌細胞株LM3和MHCC-97H購自復旦大學IBS細胞資源中心。(2)主要試劑及耗材：無內毒素質粒小提中量試劑盒和凝膠純化試劑盒購自天根生化科技有限公司。限制性內切酶AgeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、Phanta保真酶、T4 DNA連接酶及Script SYBR Green PCR 購自美國Thermo Fisher Scientific公司。DH5α、結晶紫溶液、腺苷-5-單磷酸二鈉鹽和4%多聚甲醛購自生工生物工程股份有限公司。Transwell小室購自英國Corning公司。抗體ADSS購自英國Abcam公司，N-cadherin、E-cadherin及GAPDH購自美國Santa Cruz公司，Vimentin購自美國Proteintech Group公司，Flag 購自美國Sigma-Aldrich公司。

2.實驗方法：(1)數據獲取：UALCAN網頁分析TCGA中ADSS的表達，數據包括371例肝癌組織與50例正常組織。使用Kaplan-MeierPlotter對肝癌患者的5年生存期進行分析，生存期分析中按ADSS的中位表達量將其分為低表達ADSS的肝癌患者(180例)和高表達ADSS的肝癌患者(184例)。(2)細胞培養：細胞采用DMEM高糖培養基培養。培養時加入10%的胎牛血清，100U/L的青霉素與鏈霉素，細胞的培養條件為37℃、95%飽和濕度及5%CO2。(3)蛋白印跡法：裂解液提取細胞的總體蛋白，BCA法檢測蛋白質濃度，蛋白印跡法檢測蛋白的表達。SDS-PAGE凝膠電泳后，100V恒壓轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗于4℃搖床孵育過夜，次日用PBST洗3次，每次10min，二抗在室溫下孵育2h， PBST洗3次后化學發光成像。(4)質粒構建：shRNA的質粒載體為pLKO.1，酶切位點為AgeⅠ，過表達質粒載體為pLVX-IRES-Neo-3xFlag，酶切位點為EcoRⅠ及BamHⅠ，引物序列詳見表1。(5)慢病毒包裝：293T提前鋪板，密度約為80%～90%，細胞貼壁后，將慢病毒包裝質粒pMD2.G，psPAX2、目的質粒及轉染試劑加入500μl培液中，混勻后靜置15min后加入293T中，培養48h后收集上清，離心過濾后使用。(6)細胞系構建：細胞鋪板密度為30%～40%，待其貼壁后，加入2ml病毒，500μl DMEM完全培養基，加入Polybrene篩選細胞，培養箱培育8h，換為2ml完全培養基。兩天后添加1μg/ml的嘌呤霉素持續篩選。(7)瞬時轉染：由于HepG2敲減穩定株的效果不明顯，故使用瞬時轉染進行實驗，細胞鋪板密度約為60%～70%，提前2h換液，將目的質粒及轉染試劑加至500μl的培液中混勻，靜置15min后加入細胞中，轉染24h后進行其他實驗。(8)細胞劃痕實驗：在6孔板背面每隔1cm劃線，每孔種入5×105個細胞，待細胞貼壁并長滿后使用200μl的槍頭劃線，PBS沖洗3次后加入無血清培養基，細胞培養箱中培養，在0、24、48h于顯微鏡下拍照。(9)Transwell實驗：Transwell實驗采用8μm聚酯膜小室。消化細胞，離心后PBS洗2次，用無血清DMEM重懸細胞，取200μl 含3×105細胞無血清培養基加入小室，下室加入600μl含15% FBS的培養基培養48h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗后結晶紫染色20min，PBS清洗后用棉簽擦拭小室上層，顯微鏡下取5個視野拍照。(10)實時熒光定量PCR：Trizol法提取細胞RNA,并反轉錄為cDNA，實驗Script SYBR Green PCR 試劑盒及羅氏LightCycler96檢測儀檢測相關基因的表達。以GAPDH為內參，mRNA的相對表達量采用2-△△Ct法計算，引物序列詳見表1。(11)AMP回補實驗：腺苷-5-單磷酸二鈉鹽用稀鹽酸溶解，使用PBS將其稀釋為100mmol/L的母液。細胞處理濃度為100nmol/L，其對照組加入相應濃度的鹽酸。

表1 質粒及實時定量熒光PCR引物

3.統計學方法：使用GraphPad Prism 6.0統計學軟件對數據進行統計分析，組間比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.ADSS在肝癌中表達量及與肝癌患者的5年生存率相關性：使用UALCAN數據庫對TCGA的肝癌組織分析發現在肝癌組織中ADSS的表達上調(圖1A)。使用Kaplan-MeierPlotter分析發現ADSS高表達患者5年生存率明顯低于ADSS低表達患者(圖1B)。隨后在蛋白水平進行分析，與肝臟正常細胞LO2比較，肝癌細胞ADSS的表達量增加，而在mRNA水平大多數肝癌細胞表達量增加。

圖1 ADSS在肝癌中表達量及肝癌患者的5年生存率相關性A.肝癌組織與正常肝組織ADSS的mRNA表達量；B.ADSS表達水平與患者5年生存率相關性；C.肝癌細胞及正常肝臟細胞ADSS的蛋白表達量；D.肝癌細胞與正常肝臟細胞中ADSS的mRNA的表達量。*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

2.ADSS沉默效果及肝癌細胞間的黏附性改變：為了探究ADSS在肝癌中的生物學作用，在ADSS表達較高的HepG2及LM3中沉默ADSS基因，蛋白免疫印跡結果顯示沉默ADSS的肝癌細胞ADSS的表達量明顯下調(圖2A、圖2B)，并且使肝癌細胞間黏附性發生改變(圖2C)。

圖2 ADSS沉默效果及肝癌細胞間的黏附性改變A.HepG2細胞ADSS基因沉默效果驗證；B.LM3細胞ADSS基因沉默效果驗證；C.ADSS基因沉默后細胞黏附性發生改變(×200)

3.ADSS對肝癌細胞的遷移的影響：使用細胞劃痕實驗對肝癌細胞的遷移能力進行檢測，ADSS基因沉默后明顯抑制了HepG2及LM3的遷移能力(圖3A、圖3B)。使用Transwell實驗對肝癌的遷移能力進行驗證，在HepG2及LM3中沉默ADSS基因后遷移能力明顯減弱(圖3C)。

圖3 ADSS對肝癌細胞的遷移的影響A.細胞劃痕實驗檢測ADSS基因沉默對HepG2遷移功能的影響(×100)；B.細胞劃痕實驗檢測ADSS基因沉默對LM3遷移功能的影響(×100)；C.Transwell實驗檢測ADSS基因沉默對肝癌細胞HepG2及LM3遷移功能的影響(結晶紫染色，×200)。*P=0.000

4.ADSS對肝癌細胞上皮間質化的影響:使用EMT相關抗體對沉默ADSS的細胞進行檢測，結果發現在沉默ADSS的HepG2及LM3中EMT相關指標N-cadherin、Vimentin均較對照組細胞明顯下調，E-cadherin較對照組明顯增加(圖4)。

圖4 ADSS對肝癌細胞上皮間質化的影響A.HepG2細胞中ADSS基因沉默后EMT相關指標的影響；B.LM3細胞中ADSS基因沉默后EMT相關指標的影響

5.ADSS基因及代謝產物回補恢復了LM3-Sh-ADSS細胞的遷移能力：為了確定ADSS的表達在細胞遷移中的作用，對LM3-Sh-ADSS2進行基因及代謝產物回補。ADSS的基因回補完全恢復了EMT相關標志物的表達及LM3的遷移能力(圖5、圖6A)，而在代謝產物回補實驗中，由于其下游代謝產物AMP的細胞吸收及利用率有限，其EMT相關分子標志物及細胞的遷移功能僅得到部分回復(圖5、圖6B)。

圖5 ADSS基因及代謝產物回補對EMT相關分子的影響

圖6 ADSS基因及代謝產物回補恢復了肝癌細胞的遷移能力A.細胞劃痕實驗檢測ADSS代謝產物回補及基因回補對肝癌細胞遷移功能的影響(×100)；B. Transwell實驗檢測ADSS代謝產物回補及基因回補對肝癌細胞遷移功能的影響(結晶紫染色，×200)。*P<0.05,**P=0.000

討 論

肝癌在我國是一種高發生率、高致死率的惡性腫瘤，其發生、發展是一個典型的多階段演變過程[11～13]。目前肝癌的發病原因及具體機制尚不明確，故筆者以肝癌為研究對象，力圖尋找肝癌新的診斷及治療靶點。腫瘤與代謝是當今生命科學領域新的研究熱點之一，多篇文獻報道嘌呤在腫瘤發生過程中常存在代謝失衡[14，15]。參與嘌呤核苷酸從頭合成及補救途徑的多種代謝酶在腫瘤發生時異常上調，并且通過多種途徑促進腫瘤的發生、發展[16]。ADSS作為嘌呤核苷酸從頭合成中的關鍵酶，參與ATP的合成，TCGA數據庫中顯示ADSS在肝癌中高表達，而其在腫瘤中的具體作用及機制至今無人報道，故本文探究了ADSS在肝癌發生、發展中的作用。

本研究通過對TCGA進行研究發現，肝癌組織中ADSS的表達水平明顯高于正常組織，且ADSS高表達的肝癌患者較ADSS低表達的肝癌患者5年生存率明顯降低，隨后對肝癌細胞及肝臟正常細胞的蛋白及mRNA水平進行檢測，結果發現與正常肝臟細胞比較ADSS在肝癌細胞表達量增加。沉默肝癌細胞ADSS后發現，ADSS的缺失導致細胞間黏附性的改變，進一步的生理功能研究結果發現ADSS的下調抑制肝癌細胞的遷移能力。因此可以推斷ADSS在肝癌的轉移中發揮了重要作用。

腫瘤的浸潤與轉移是腫瘤患者預后不良的重要原因，多篇文獻表明肝癌的轉移與EMT的過度激活密切相關[17，18]。其常通過改變細胞間及細胞與基質間的相互作用進而促進腫瘤的浸潤與轉移，而在EMT發生的過程中上皮標志物E-cadherin、Vimentin表達量的減少，間質標志物N-cadherin表達量的增加是其標志性的改變[19]。使用EMT相關抗體檢測發現沉默ADSS顯著改變EMT相關蛋白的表達，這表明ADSS可能通過激活EMT促進了肝癌的轉移，隨后對ADSS基因沉默的LM3-ShADSS2進行基因及代謝產物回補，結果發現ADSS的基因及代謝產物回補恢復了ADSS缺失造成的EMT分子標志物及遷移的改變。本研究揭示了ADSS對肝癌遷移的影響，后期筆者將進一步研究ADSS在肝癌中調控的具體機制，進行體內實驗探索ADSS在體內存在的意義。

綜上所述，ADSS在肝癌中表達量增加，其表達與患者的5年生存率呈負相關，在肝癌中ADSS對肝癌細胞遷移具有一定的促進作用。因此，ADSS或可為肝癌的早期診斷及治療提供新的思路。