創傷后應激障礙小鼠海馬神經細胞內FoxO3a和LC3蛋白的表達變化

王瓊峰 韓雨清 周 陽 孫 卓 包海軍 蒯錦霞 蔡紅星

創傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)又稱延遲性心因性反應，是指突發性、威脅性、災難性等刺激性生活事件或處境所導致個體延遲出現和長期持續存在的精神障礙。PTSD作為一種嚴重的精神疾病，其臨床表現以闖入性創傷再體驗癥狀(閃回)、回避和麻木類癥狀、持續性焦慮和警覺水平增高癥狀為主要特征[1,2]。

對PTSD患者的研究發現，在創傷刺激期間，海馬等多個腦區在短期內可發生神經可塑性改變，神經細胞內鈣離子調控紊亂，線粒體功能受損從而導致神經細胞受損[3]。在慢性刺激過程中，遭受刺激患者腦內自由基水平較正常增高，這會引起神經細胞脂質過氧化，導致由自由基介導的病理和隨后的神經毒性，引起神經細胞凋亡、壞死、其他結構細胞損傷和修飾[4]。這些研究證明刺激反應會損傷大腦，引起腦內神經細胞的損傷。腦功能的預后與各種繼發性損傷密切相關，如自噬等重要分子機制同樣參與了腦神經細胞繼發性死亡的過程。FoxO3a轉錄因子是Fox基因O亞家族的一個重要成員，其在細胞的增殖、凋亡、自噬、炎癥等生物進程中發揮著重要作用[5]。近年來研究發現，FoxO3a是刺激反應中多個分子信號通路的交匯點，當機體遭受刺激時，FoxO3a能夠通過影響自噬基因的表達來激活不同類型細胞的自噬機制。但目前在PTSD模型中，FoxO3a參與神經細胞自噬的調控較少有相關文獻報道。本研究通過檢測SPS刺激下小鼠的行為學改變及小鼠海馬神經細胞內FoxO3a、LC3蛋白的表達情況，初步研究PTSD小鼠海馬神經細胞自噬過程中FoxO3a蛋白的表達變化。

材料與方法

1.實驗材料： (1)動物：成年雄性昆明小鼠68只，體質量25～30g，購自徐州醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(蘇)2016-0028。(2)試劑：BCA蛋白含量檢測試劑盒(編號KGP902)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒(編號P10100)購自蘇州新賽美生物科技有限公司；兔抗Akt抗體(編號#4691)、兔抗p-Akt抗體(編號#13038)、兔抗FoxO3a抗體(編號#2497)、兔抗p-FoxO3a抗體(編號#9466)、兔抗LC3B抗體(編號#3868)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗P62抗體(編號sc-25575)購自美國Santa Cruz Bio-technology公司；兔抗β-actin抗體(編號20536-1-AP)和山羊抗兔IgG二抗(編號SA00001-2)購自美國Proteintech Group公司。

2.動物分組：行為學檢測(共20只)，隨機分為Control組和PTSD組，每組各10只；Western blot法檢測實驗(共36只)，隨機分為Control組(6只)和PTSD組，PTSD組依照1、3、7、14、28天5個時間點各設亞組，每個亞組各隨機分配6只；免疫熒光檢測實驗(共12只)，隨機分為Control組和PTSD組，每組各6只。

3.PTSD動物模型的制備：首先小鼠適應性飼養1周，采用國際上公認的單一連續刺激(single prolonged stress，SPS)方法制備PTSD小鼠模型[6]：先將小鼠禁錮2h，之后立即將禁錮解除的小鼠強迫游泳20min(水深40cm，水溫25℃)，休息15min后進行乙醚麻醉至小鼠意識喪失，待其自然蘇醒后分籠常規飼養，期間不再給予小鼠任何刺激。

4.曠場實驗：本實驗采用曠場實驗箱，平均分為底面積相等的4個箱體，每個箱體規格50cm×50cm×40cm，箱體外周壁為黑色，靠壁底部區域面積組成外周活動區，其余部分區域面積組成中央活動區。測試前將小鼠放置于曠場實驗箱中適應15s，實驗開始時，將小鼠放置于曠場正中央，在操作者完成放開小鼠動作的同時，實驗箱正上方的攝像機開始同步跟蹤記錄，記錄時間為5min。本次曠場實驗評估指標為小鼠的活動總路程(外周區域+中央區域)、中央區域活動的路程、中央區域停留的時間。

5.高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮裝置由白色不透明有機材料制成，整個裝置離地0.5m高，由兩個開臂大小為長×寬(30cm×6cm)、兩個閉臂大小為長×寬×高(30cm×6cm×15cm)及開臂和閉臂之間的中央區域(6cm×6cm)組成。實驗開始時，將小鼠放置于高架十字迷宮的中央區域，頭部統一朝向開臂方向，釋放后實驗人員迅速離開的同時，啟動攝像系統開始跟蹤記錄，記錄時間為5min，實驗中跌落的小鼠則淘汰此數據。本次高架十字迷宮實驗評估指標：小鼠進入開臂次數占總次數(進入開臂次數+進入閉臂次數)的百分比、小鼠在開臂停留時間占總停留時間(開臂停留時間+閉臂停留時間)的百分比。

6.Morris水迷宮實驗：水迷宮為一個黑色圓形水池(直徑105cm，高50cm)，池內水深30cm，水溫25℃左右，水池均等分為4個象限，將一個直徑為6cm的白色透明圓形站臺放置于靶象限(設為第一象限)內，站臺位置距離池壁30cm，高度低于水面下1cm。具體實驗步驟：(1)定位航行實驗：每只小鼠每天訓練4次，每次間隔1min，持續訓練4天。實驗前，去掉站臺，讓小鼠自由游泳60s以充分適應環境。實驗開始時，將站臺隱蔽于第一象限內，將小鼠頭朝池壁隨機從東北(NE)、東南(SE)、西南(SW)、西北(NW) 4個方向放入水池內，自由游泳60s尋找隱蔽的站臺，60s內找到站臺，記錄所用時間為逃避潛伏期。若60s內未找到站臺的小鼠，引導至站臺，站臺上停留30s，記錄逃避潛伏期為60s。(2)空間探索實驗：學習的第5天撤掉水下站臺，從目標象限(站臺)的對側象限，將小鼠頭朝池壁放入水池內，記錄60s內小鼠的運動軌跡和目標象限(站臺)停留情況。本次Morris水迷宮實驗評估指標：60s內小鼠的逃避潛伏期、穿越原站臺次數、原站臺象限的停留時間。

7.Western blot法檢測：冰臺上操作剖離海馬組織，預先按RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例混合配制好蛋白組織裂解液，加入裂解液充分勻漿組織，冰上靜置裂解30min，高速低溫(13000r/min，20min)后取上清液。BCA法測定各組蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃變性15min。配置SDS-PAGE凝膠，濃縮膠恒壓80V電泳30min，分離膠恒壓110V電泳至溴酚藍到達分離膠底部，用電轉法將蛋白質轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2h；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×3次；二抗室溫孵育2h，TBST洗膜10min×3次。PVDF膜上滴加ECL化學發光液，暗室內曝光，凝膠成像分析系統成像。

8.免疫熒光染色實驗：小鼠腦組織灌注取材，放置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定36h，經20%、30%蔗糖溶液中4℃梯度沉糖脫水，冷凍切片機海馬冠狀切片，厚度20μm，-20℃保存備用。用時室溫放置復溫30min，PBS洗5min×3次；0.3%TritonX-100通透10min，PBS洗5min×3次；10%山羊血清封閉1h；一抗4℃孵育過夜，第2天室溫孵育30min進行復溫，PBS洗10min×3次；熒光二抗室溫避光孵育2h，PBS洗10min×3次；DAPI復染核，室溫孵育10min，PBS洗5min×3次；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

結 果

1.曠場實驗檢測：與Control組比較，PTSD組小鼠在曠場實驗箱內活動總路程明顯減少(P<0.01)，其在中央區域活動路程、中央區域停留時間也均減少(P<0.01，圖1)。

圖1 兩組小鼠曠場實驗檢測結果(n=10)A.運動軌跡結果圖；B.兩組小鼠在曠場箱內活動總路程、中央區域活動路程和停留時間的比較；與Control組比較，*P<0.01

2.高架十字迷宮實驗檢測：與Control組比較，PTSD組小鼠進入開臂次數百分比、開臂停留時間百分比均明顯降低，兩組結果比較差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。從小鼠的運動軌跡及測試分析結果發現，與Control組比較，PTSD組小鼠在閉臂內的活動總路程和總時間顯著高于開臂。

圖2 兩組小鼠高架十字迷宮檢測結果(n=10)A.運動軌跡結果圖；B.兩組小鼠進入開臂次數和開臂停留時間百分比的比較；與Control組比較，*P<0.01

3.Morris水迷宮實驗檢測：在定位航行實驗中，與Control組比較，PTSD組小鼠逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)；在空間探索實驗中，與Control組比較，PTSD組小鼠穿越原站臺的次數和原站臺象限的停留時間明顯減少(P<0.01，圖3)。

圖3 兩組小鼠Morris水迷宮檢測結果(n=10)A.運動軌跡結果圖；B.兩組小鼠逃避潛伏期、穿越原站臺次數、原站臺象限的停留時間比較；與Control組比較，*P<0.01

4.Western blot法檢測自噬信號通路相關蛋白的表達：與Control組比較，PTSD組小鼠海馬神經細胞p-Akt蛋白表達水平在1天時出現激活上調，之后表達開始下降；PTSD組海馬組織FoxO3a蛋白表達增加，p-FoxO3a蛋白表達減少；PTSD組海馬自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，p62蛋白表達水平降低，兩組結果比較差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。SPS刺激后PTSD組各組蛋白表達隨時間點變化而變化，FoxO3a蛋白能夠在短暫SPS刺激下，迅速感受Akt蛋白的變化；SPS刺激后7、14天時間點，觀察到PTSD小鼠海馬LC3明顯增多，FoxO3a蛋白表達水平也隨之增加。

圖4 Western blot法檢測各組蛋白的表達情況(n=3)與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.免疫熒光檢測小鼠海馬神經細胞內FoxO3a和LC3的表達：熒光顯微鏡下觀察發現，FoxO3a蛋白與CoraLite488標記的熒光二抗結合，其陽性反應呈現綠色熒光；LC3蛋白與CoraLite594標記的熒光二抗結合，其陽性反應呈現紅色熒光；DAPI熒光染料對細胞核進行標記，發出藍色熒光。在小鼠海馬神經細胞內，FoxO3a和LC3蛋白呈現不同部位的表達分布，有的表達于胞質，有的可見表達于胞核；與Control組比較，PTSD組海馬神經細胞內FoxO3a和LC3蛋白所呈現的綠色熒光和紅色熒光信號強度均較Control組明顯增強，且二者與DAPI疊加后的熒光強度也高于Control組(圖5)。

圖5 免疫熒光染色檢測兩組小鼠海馬神經細胞內FoxO3a和LC3的表達情況(×400，n=6)A.海馬神經細胞內FoxO3a的熒光表達；B.海馬神經細胞內LC3的熒光表達

討 論

PTSD疾病診斷難、發生率高、病程長、療效差，是由刺激性事件引起的典型疾病之一，近年來成為了研究的熱點，目前對于PTSD的治療僅局限于心理、情緒方面的對癥治療，經治療后患者的癥狀也很難完全消失，對于產生該問題的主要癥結在于PTSD的發病機制尚未完全闡明。許多因素影響到PTSD的發生，如存在精神障礙的家族史與既往史、童年時代的心理創傷(如遭受性虐待、10歲前父母離異)、性格內向及有神經質傾向、創傷事件前后有其他負性生活事件、家境不好、軀體健康狀態欠佳等，這些現象目前還在深入的研究中[7～9]。

有研究表明，PTSD患者的海馬體積部分萎縮，提示PTSD發病過程中患者海馬神經細胞發生了異常的損傷、死亡和丟失[10,11]。動物模型研究發現，海馬部位存在有明顯的神經細胞凋亡現象[12]。國內外研究者已經證實PTSD后神經細胞凋亡高峰并不發生在創傷刺激后的早期階段，說明PTSD后神經細胞死亡為一長期、持續的繼發性損傷過程，但本病的發病機制尚未完全闡明。PTSD發病過程中海馬神經細胞的異常丟失和死亡除了與神經細胞凋亡有關外，是否同時存在其他損傷因素尚不明確。腦功能的預后與各種繼發性損傷密切相關，神經細胞繼發性損傷可造成腦組織結構與功能的進一步損害，是導致腦功能障礙的重要原因之一。反復發生的慢性刺激，可能通過一系列的病理生理變化、興奮性毒性等因素引起隨后的神經細胞死亡和神經功能紊亂，如運動、感覺、學習和記憶障礙[13,14]。

自噬現象是細胞內一種正常的生理活動，在維持中樞神經系統正常功能方面起著重要作用，在神經變性疾病中，自噬受損可能導致神經細胞的損傷[15]。在多數細胞正常情況下，自噬處于相當低的水平，但當機體處于刺激狀態時，體內細胞的自噬可以被激活而呈現高水平，表現為自噬增強。當機體和體內的細胞遭受的刺激過多、程度過強時，自噬可以被過度激活，從而引起不可逆的細胞死亡，對機體造成損害，引起相關疾病的發生。

本研究通過SPS刺激方法建立PTSD小鼠模型，采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗、Morris水迷宮實驗檢測SPS刺激后小鼠的行為學變化。曠場實驗是檢測動物焦慮水平的經典行為學方法，用來評定動物的警覺水平、焦慮狀態和環境適應能力。本次檢測結果發現，SPS刺激后小鼠的活動總路程明顯減少，反映遭受刺激后小鼠對新環境的好奇感減弱，探索興趣下降，同時，觀察到小鼠常蜷縮在曠場箱體的角落旁，中央區域活動路程和停留時間減少，反映小鼠對開闊曠場環境保持警覺和害怕的心理。高架十字迷宮是檢測動物焦慮和恐懼水平的實驗設備，本次檢測結果發現，SPS刺激后小鼠傾向于活動在兩側閉臂內，并喜好躲藏在閉臂角落處，反映遭受刺激后小鼠對重新體驗創傷情景(高懸開臂危險)的回避，表現出恐懼水平較高，有明顯的焦慮樣行為。Morris水迷宮是檢測動物空間學習和記憶能力的首選經典實驗，逃避潛伏期是站臺隱蔽試驗中的重要檢測指標，是反映小鼠尋找水下隱蔽站臺所花費的時間，這個指標用時越短說明小鼠的空間學習和記憶能力越強，相反則說明小鼠的空間學習記憶能力受損。小鼠穿越原站臺的次數和原站臺目標象限的停留時間，這兩個指標主要反映小鼠在較長時間內的記憶保持能力。本次檢測結果發現，SPS刺激后小鼠找到站臺的時間明顯延長，運動軌跡紊亂，沒有定向尋找站臺的目的性，表明SPS刺激后小鼠的空間定位能力減弱，學習記憶能力受損。綜合以上行為學結果可知，SPS刺激后小鼠表現出PTSD疾病的主要核心癥狀，即焦慮和恐懼水平提高，環境適應減弱，探索興趣下降，逃避反應延遲，學習記憶能力下降。

近年來對FoxO3a的作用機制研究逐漸從腫瘤細胞轉移到了神經細胞，FoxO3a在多種神經系統疾病中發揮著重要作用。大量研究發現，FoxO3a 在缺血引起的神經細胞凋亡中發揮重要作用，可作為治療海馬神經損傷及認知障礙的靶向基因[16]。在小鼠神經干細胞的研究中發現，FoxO3a基因還參與了促進神經細胞的分化[17]。在運動性神經疾病中，FoxO3a發揮神經保護作用，細胞核內FoxO3a的激活可以抑制由興奮性神經毒素的表達引起的神經細胞死亡[18]。研究還發現，刺激引起的神經細胞損傷，其損傷程度在大腦不同細胞與區域間有差異，其中海馬CA1區神經細胞尤其易受損傷,且隨著年齡增長而加劇。Jackson等[19]研究認為，CA1區的易損性與FoxO3a在CA1區大量表達有關。

FoxO3a具有磷酸化和非磷酸化兩種形式，其中非磷酸化形式的FoxO3a被認為具有轉錄激活活性分子，磷酸化在其活性及細胞內轉移作用中起到關鍵作用，FoxO3a是PI3K/Akt信號通路下游的重要轉錄因子，在細胞應激研究中，當Akt磷酸化水平被抑制時，無法激活磷酸化的FoxO3a，使其與胞核輸出蛋白14-3-3特異性結合受阻，導致FoxO3a在胞核內大量表達，從而增加細胞自噬[20]。同時，在本研究PTSD小鼠模型中，結果也發現，SPS刺激后小鼠海馬神經細胞內p-Akt水平隨時間延長表達下降，p-FoxO3a水平表達受阻，同時，觀察到LC3和FoxO3a蛋白水平增加，熒光表達強度增強，結果提示PTSD疾病神經細胞自噬發生中可能存在FoxO3a的表達。但是由于PTSD后神經細胞自噬的具體作用機制相當復雜，FoxO3a與神經細胞自噬之間的關系仍有待于進一步研究。