間充質干細胞外泌體在口腔組織再生中的研究進展

胡冰濤 王曉春

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為成體干細胞的一種，可以從骨髓、脂肪、外周血和牙髓等成體組織中分離，具備多向分化能力、高度增殖能力、免疫調節能力和致畸風險低等優點，被廣泛應用于多種疾病的治療中[1]。但同時干細胞療法也存在一些問題，如機體免疫排斥、干細胞遺傳物質變異和體外擴增不易保存等問題[2]。近年來研究發現，MSCs可釋放出大量細胞外納米顆粒參與組織損傷修復過程，外泌體作為其中之一備受關注。外泌體是由真核細胞向胞外分泌的微囊泡，含有多種蛋白質、脂質和遺傳物質，參與細胞間信號傳遞和遺傳物質轉運等多種生理、病理過程。在臨床診療過程中，口腔頜面部血管、神經、牙齒和關節軟骨等組織的損傷，嚴重危害患者的身心健康。然而利用MSCs外泌體既可保留干細胞原有功能，又可以避免細胞移植相關的風險和限制[3]。因此，MSCs外泌體有可能作為無細胞療法在口腔頜面部組織再生研究領域中的潛在解決方案。

一、外泌體概述

1.外泌體的生物學特征：外泌體最初是在成熟哺乳動物的網織紅細胞中發現的，是直徑約30～150nm的細胞外囊泡，密度為1.11～1.19g/ml，在透射電鏡下觀察多數為圓形或杯形。外泌體可由不同類型的細胞分泌釋放，如神經細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞和干細胞等，并廣泛存在于各種體液中[4]。人們普遍認為，外泌體的形成始于細胞內陷的后期，在與細胞膜接觸后以“內吞-融合-外排”的形式排出，形成具有磷脂雙層膜結構的囊泡體[5]。外泌體中所含有的蛋白質主要包括參與其結構形成的膜轉運和融合相關蛋白Rab、膜聯蛋白及各類運輸蛋白，還有四跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81和CD82等)、熱休克蛋白家族和各種特異性蛋白質分子。外泌體依靠其豐富的脂質如膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等維持形態，同時也可以傳遞信號分子介導的生物信息[6]。外泌體內部含有特定的遺傳信息和細胞因子可以使其作為介入靶點，在促進組織修復再生、免疫調節、抑制細胞凋亡及調控腫瘤生長等方面發揮重要作用[7,8]。

外泌體對受體細胞的生物學作用可能有兩種機制：①外泌體膜蛋白直接或間接與靶細胞相互作用并激活細胞內信號傳遞的內吞作用；②外泌體與靶細胞膜融合或被靶細胞內吞，以非選擇性的方式釋放其“貨物”(miRNA、蛋白質和mRNA)進入靶細胞，從而調控基因表達和一系列后續的生物學效應[9]。

2.外泌體的提取、保存及鑒定：外泌體是納米級大小的細胞外囊泡，因其體積較小導致提取難度較大。目前用于外泌體的提取技術主要有：超速離心法、超濾法、免疫親和法、聚合物沉淀法、分子排阻色譜法和集成微流控法等[10]。盡管這些方法已廣泛應用，但仍有其缺點，比如提取純度低、獲取量少、耗費時間長、可能對外泌體造成機械損傷等，并且不同的提取方法得到的外泌體的理化性質各不相同，這會對后續的實驗研究帶來極大的不可控性。所以，外泌體的提取問題仍然是未來外泌體應用發展的關鍵。

合理的保存方法對維系外泌體的直徑和完整性有著重要的作用。研究表明，將已成功提取的外泌體放在常溫下保存2天后，直徑降低60%。在4℃環境下保存3～4天后，直徑降低25%。在-20℃環境下，其直徑在1周以內無明顯變化。而在-80℃環境下的外泌體可以維持穩定狀態，適宜長期儲存[11]。

外泌體的鑒定通常會采用觀察形態學特征、分析粒徑分布大小和檢測特異性蛋白標志物等方法。目前用于鑒定的儀器主要有透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、冷凍電子顯微鏡、原子力顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析儀、流式細胞儀、免疫印跡分析儀和酶聯免疫檢測儀等。而一般實驗研究會使用以上2～3種方法或儀器進行聯合鑒定。

二、外泌體在口腔組織再生中的研究

1.血管組織再生：血運重建是口腔頜面部組織損傷后修復與再生中不可缺少的過程，豐富的血運形成對新生組織的生長具有促進作用，是機體生長發育的重要基礎。牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是MSCs的一個亞群，它不僅與MSCs有極其相似的免疫表型和增殖分化能力，而且來源豐富，取材簡便，無倫理爭議[12]。Xian等[13]探究DPSCs外泌體在人臍靜脈內皮細胞中的促血管生成特性，隨后發現外泌體可以促進內皮細胞的增殖和促血管生成因子的表達，并且通過使用P38 MAPK抑制劑提升了血管形成能力。還有研究發現，過表達低氧誘導因子的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)來源的外泌體可通過增強Notch信號通路中Jagged1的表達促進血管生成能力，這可能在口腔組織再生治療方面有潛在的應用[14]。Qiu等[15]在小鼠皮膚損傷模型的體內實驗中發現，由新生小鼠血清培養的MSCs外泌體通過AKT/eNOS信號轉導通路調節內皮細胞的功能，促進了傷口愈合和血管生成，為皮膚損傷修復提供了一種新的無細胞治療策略。

綜上所述，MSCs來源的外泌體主要通過增強血管內皮細胞的活性和增殖能力，在血管生成中起到重要作用，這為外泌體應用于口腔頜面部組織損傷后修復與再生提供新思路。但是不同來源的MSCs外泌體在促血管形成能力上有很大差異，未來需要投入更多精力去尋找最適宜血管組織再生的外泌體來源。

盡管目前大部分的研究局限于體外觀察，并且MSCs外泌體對神經再生的作用機制仍需進一步探索，但其神經組織保護與促進神經再生作用已為口腔頜面部組織的再生提供新策略。

3.牙髓組織再生：牙髓組織容易因齲病、外傷、牙周炎逆行性感染等因素發生炎癥，炎癥的持續發展會導致牙髓及根尖部周圍組織壞死[20]。根管治療是牙髓疾病中常用的治療方法，在這個過程中，完全去除發炎或壞死的牙髓，并用合成材料嚴密封閉整個根管系統。雖然根管治療已被證明是有效的，但由于失去天然牙髓組織的營養和保護作用，剩余的牙齒結構抗力下降，脆性增加，有牙折的風險。因此，牙髓組織再生的作用顯得尤為重要。

Huang等[21]探索了DPSCs外泌體誘導牙源性分化的潛力，發現外泌體可以與基質蛋白(例如Ⅰ型膠原蛋白和纖維蛋白)相結合，從而使它們能夠附著于生物材料，通過內吞機制被DPSCs內吞并觸發P38 MAPK信號途徑，促進牙源性分化和組織再生。此外在其牙根切片模型上也證明了外泌體可以誘導牙髓樣組織的再生。Hu等[22]分別從正常條件下和牙源性分化條件下培養的DPSCs中提取外泌體并進行miRNA測序，結果表明，牙源性分化條件下培養DPSCs所得到的外泌體被內吞后，通過上調DSP、DMP-1、ALP和RUNX2蛋白誘導DPSCs牙源性分化。進一步研究發現，外泌體中的miRNA通過下調隱性TGF-β結合蛋白1促進了由TGF-β1/Smads信號轉導通路介導的牙源性分化。Zhuang等[23]將來自根尖乳頭的干細胞(stem cells from apical papilla，SCAP)分泌的外泌體引入含有BMSCs的牙根片段中，并將其皮下移植到免疫缺陷小鼠體內，結果觀察到有牙髓牙本質復合物樣組織生成，結合體外研究發現，經SCAP外泌體處理的BMSCs中牙本質涎磷蛋白基因的表達以及礦化結節的形成均顯著增加，這說明使用牙源性MSCs外泌體試劑可能是實現牙髓組織損傷后修復與再生的新選擇。

4.牙周組織再生：牙周炎是導致牙周支持組織發生慢性進行性破壞的一種炎癥性疾病，可引起牙槽骨的吸收和牙周附著喪失，是導致成年人牙齒松動、脫落的主要原因。因此，實現牙槽骨再生和恢復牙周附著水平是獲得牙周組織再生的關鍵步驟。

Wei等[24]將SHED來源的外泌體注射到小鼠牙周炎模型的骨缺損區域中，結果發現，外泌體修復骨缺損的程度和原始干細胞相同，并且還可以特異性促進BMSCs的成骨作用與抑制脂肪的形成。Chew等[25]將負載有人MSCs源性外泌體的膠原蛋白海綿作用于牙槽骨缺損的大鼠模型，結果觀察到牙槽骨和功能性牙周膜纖維的再生。體外實驗進一步證明，MSCs外泌體通過激活AKT和ERK信號通路，促進了牙周膜細胞的增殖和遷移，從而實現缺損骨組織的再生。綜上所述，外泌體可以通過促進骨缺損區域周圍細胞的增殖和成骨分化，實現牙周組織的再生。

5.關節軟骨組織再生：顳下頜關節(temporomandibular joint，TMJ)是由下頜骨髁突和顳骨之間形成的纖維軟骨覆蓋的復雜關節。在TMJ疾病治療中，越來越多的研究者將干細胞、支架和外泌體結合在一起進行研究。Luo等[26]研究發現，來自SHEDs攜帶miR-100-5p的外泌體通過激活mTOR信號通路抑制TMJ中軟骨細胞的炎性反應。Zhang等[27]將MSCs外泌體注射到單碘乙酸誘導的TMJ骨關節炎大鼠模型的關節腔室中，通過調節炎性反應，外泌體明顯加快了髁突軟骨和軟骨下骨的愈合，促進了關節軟骨組織的修復和再生，這不僅證明了MSCs外泌體在TMJ疾病治療中的潛力，而且在關節軟骨再生領域展現出良好的應用前景。

三、外泌體在組織工程的應用

近年來，以細胞為基礎的組織工程取得了良好的臨床效果，然而干細胞移植的非定向分化、免疫排斥和醫學倫理學爭議等問題限制了其應用潛能。因此，研究者也在積極地探索其他的無細胞治療方法。作為MSCs旁分泌作用的重要組成部分，基于外泌體的治療在口腔組織工程中顯示出令人興奮的應用前景。Swanson等[28]使用一種以降解性能可調的自組裝合成為基礎的三嵌段共聚物載體來封裝和控制釋放牙源性干細胞外泌體，并通過大鼠牙髓切除模型評估其作為生物材料在牙髓再生治療中的潛力。結果發現，釋放出來的外泌體促進了牙源性基因的表達和修復性牙本質的形成，并誘導牙髓組織再生。Ivica等[29]將DPSCs外泌體與纖維蛋白凝膠藥物傳遞系統結合，共同作用于MSCs，發現外泌體能夠顯著誘導MSCs自發性聚集并促進其增殖能力，這表明注射纖維蛋白凝膠中遞送的外泌體可能是無細胞再生牙髓治療的有力工具，有望成為填充牙體硬組織的新方法。

四、展 望

在過去的幾十年中，MSCs來源的外泌體作為再生醫學研究的焦點，得到越來越多的關注。大量實驗也圍繞它而展開，已經在各種口腔疾病的模型中取得了令人欣慰的治療效果。越來越多的證據表明，干細胞外泌體具有諸多優勢：①來源豐富，收集方法較多；②良好的生物相容性與穩定性；③分子結構較小，易通過血-腦脊液屏障，能作為天然分子載體靶向轉運藥物；④可規避干細胞移植治療的風險等。但是目前對外泌體的研究大多局限于動物模型，并沒有將其臨床應用于人類口腔組織的修復與再生。此外，關于外泌體劑量和濃度的定義也存在爭議，這需要由專業的行業協會提出相關標準。同時，明確不同細胞來源的外泌體誘導再生的作用機制依然是未來研究的重點。相信通過不斷地探索，外泌體將在再生醫學領域擁有更多令人滿意的研究成果。