乳腺癌組織中miR-502和HDAC3表達的相關性及其臨床意義

趙云飛， 何 姣， 楊 玲， 劉 智， 羅啟翅， 陳茂山

(遂寧市中心醫院 1.病理科，2.乳腺甲狀腺外科，四川省遂寧市 629000)

乳腺癌是臨床上較為常見的女性惡性腫瘤，發病率及致死率呈逐年增加趨勢，嚴重危及患者的生命安全[1-2]。隨著基因組學、生物信息學及分子生物學的不斷發展，乳腺癌標志物篩選及其靶點治療已成為關注的焦點[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)屬于非編碼小分子RNA，已有多項研究表明多種miRNA參與了癌癥、免疫、代謝等疾病的發生發展[4]。研究發現miR-502在乳腺癌[5]、宮頸癌[6]等婦科腫瘤的發生發展中起到不同程度的調節作用，可作為婦科腫瘤的抑癌基因。組蛋白修飾是導致表觀遺傳學變化的重要機制，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase3,HDAC3)在腫瘤的發生發展中起到重要的作用[7]。有研究表明HDAC3在浸潤性乳腺癌中異常高表達，起到一定的促癌基因作用[8]。本文探討miR-502和HDAC3在乳腺癌組織中表達的相關性，及對乳腺癌診斷效能和預后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2015年5月—2017年12月76例經手術病理證實的乳腺癌患者，收集其癌旁組織及癌組織標本?；颊吣挲g36～73歲，平均(55.12±7.20)歲。全部患者均簽署知情協議書，并獲本院倫理委員會批準。納入標準：手術病理學診斷為乳腺癌，并符合相關診斷標準[9]；首次確診；臨床資料齊全。排除標準：術前接受放化療及免疫治療；依從性低或精神障礙者；合并其他惡性腫瘤；嚴重內科疾病；患嚴重感染、造血功能障礙及免疫缺陷疾病。

1.2 儀器與材料

RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自默沙克生物公司；反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；miR-502、HDAC3、U6、磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物購自Takara公司；紫外分光光度計及蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；BSA試劑盒購自北京中生利康科技有限公司；HDAC3、GAPDH相關抗體、BCA試劑盒、熒光素酶試劑盒均購自Abcam公司；蘇木精購自上海博谷生物科技有限公司；圖像掃描系統購自上海涵飛醫療器械有限公司。

1.3 熒光定量PCR檢測

提取各組織中總RNA。其中miR-502以U6為內參，HDAC3以GAPDH為內參。定量RNA，將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄體系10 μL，反應條件：37 ℃、15 min×3次、85 ℃ 5 s。實施熒光定量PCR操作，反應體系50 μL：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)25 μL，PCR上游和下游引物均2 μL，ROX Reference Dye(50×) l μL，ddH2O 16 μL，DNA模板4 μL。miR-502反應條件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；72 ℃ 1 min，40個循環；HDAC3反應條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 10 s，40個循環。通過2-ΔΔCt法計算目的基因(miR-502、HDAC3)的相對轉錄水平。引物序列：miR-502正向引物：5′-ATCCTTGCTATCTGGGTGCTA-3′，反向引物：5′-CGAGCTCGGATCCACTAGTCC-3′；HDAC3正向引物：5′-CCTGGCATTGACTCATAG-3′，反向引物：5′-ATTAAGGCTCTTGGTGAAA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，反向引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′。

1.4 免疫組化

組織標本固定于10%的甲醛中，常規石蠟包埋切片(厚4 μm)，置于60 ℃溫箱1 h，常規脫蠟脫水，3%雙氧水中37 ℃孵育0.5 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗，放于0.01 mol/L檸檬酸綜合證緩沖液中，95 ℃ 20 min，冷卻至室溫，PBS沖洗。羊血清工作液封閉，37 ℃ 10 min。放入一抗：HDAC3(1∶250)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加相應的二抗室溫孵育0.5 h，顯色，蘇木精復染，封片。每張切片隨機選5個高倍視野(400×)，計算陽性細胞所占百分比，陽性細胞判定標準[9]：細胞核/細胞質內棕黃色顆粒。

1.5 免疫印跡檢測

提取組織標本中蛋白，按照BCA試劑盒說明書定量，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，將PAGE膠中蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶，室溫密封1 h，加一抗：HDAC3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，沖洗后，將相應二抗與PVDF膜至室溫孵育1 h。漂洗、化學發光、暗室曝光，顯影并定影，通過圖像掃描系統對蛋白條帶進行分析。

1.6 熒光素酶報告實驗

通過生物信息學http://www.targetscan.org/vert_72/、https://cm.jefferson.edu/網站預測miR-502和HDAC3的靶向關系，了解miR-502與HDAC3 3′UTR的結合位點。PCR反應擴增HDAC3結合位點片段，循環后72 ℃繼續延伸3 min，4 ℃保存。經瓊脂糖電泳分析，PCR產物純化，經酶切、連接、轉化、擴大菌落培養并提取質粒，構建HDAC3 3′UTR野生型(WT)質粒(HDAC3-WT)。并以質粒為基礎，構建HDAC3 3′UTR突變型(MUT)質粒(HDAC3-MUT)。將對數生長的293T細胞于96孔板中接種，待對數生長期時，將HDAC3-MUT和HDAC3-WT的載體分別和mimic-NC或miR-502 mimic共轉至293T細胞中。轉染48 h后收集并裂解細胞，離心取上清，熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.7 臨床病理特征分析

分析患者年齡、絕經狀態、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、雌激素受體/孕激素受體(ER/PR)表達情況。根據癌組織miR-502、HDAC3相對表達中位數將乳腺癌患者分為高、低表達組，分析miR-502、HDAC3不同表達水平與乳腺癌患者臨床病理資料之間的關系及對乳腺癌患者的診斷效能和預后生存的影響。患者隨訪時間至2020年12月。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 miR-502、HDAC3的溶解曲線結果

miR-502、HDAC3的產物溶解峰，擴增產物分別在84.85、84.23 ℃出現單一峰，即qRT-PCR法可以檢測組織中miR-502、HDAC3的表達且具有較高的特異度(圖1)。

圖1 miR-502與HDAC3的溶解曲線

2.2 組織標本中miR-502及HDAC3的表達情況

qRT-PCR及West blot實驗結果顯示，乳腺癌組織中miR-502表達水平顯著低于癌旁組織，而HDAC3基因、陽性表達率及其蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織(P<0.05；圖2A～C)。相關性分析結果顯示，miR-502與HDAC3在乳腺癌組織中呈負相關(P<0.05；圖2D)。網站預測HDAC3是miR-502的靶基因(圖2E、F)；熒光素酶報告實驗顯示，mimic-NC和miR-502 mimics共轉染293T細胞后的HDAC3-WT熒光素酶活性差異有顯著性(P<0.05；圖2F)。

圖2 miR-502與HDAC3之間表達關系

2.3 miR-502、HDAC3表達與乳腺癌臨床病理資料之間的關系

根據miR-502、HDAC3相對表達水平的中位數將乳腺癌患者分為低表達組與高表達組，結果顯示，miR-502、HDAC3相對表達水平與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移及ER/PR表達情況有關(P<0.05；表1)。

表1 miR-502、HDAC3基因表達與乳腺癌臨床的關系 單位：例(%)

2.4 miR-502、HDAC3基因表達對乳腺癌患者的診斷效能

乳腺癌組織中miR-502、HDAC3及二者聯合表達診斷乳腺癌患者均具有一定的診斷價值，其中二者聯合診斷價值最高(表2)。

表2 miR-502、HDAC3基因表達對乳腺癌患者診斷效能的影響

2.5 miR-502、HDAC3基因表達對乳腺癌患者預后生存率的影響

miR-502高表達組患者的3年總生存率高于低表達組(P<0.05)；HDAC3高表達組患者的3年總生存率顯著低于低表達組(P<0.05；表3)。

表3 miR-502、HDAC3基因表達對乳腺癌患者預后的影響 單位：例(%)

3 討 論

現階段多數乳腺癌患者在確診時已處于癌癥中晚期，經手術治療后預后并不理想，因此探尋診斷價值高、可較好反應預后的生物靶點，對乳腺癌篩查、診治及預后改善具有重要影響，也是現階段臨床婦科分子生物研究關注的重點[10]。microRNA異常表達參與了惡性腫瘤的發生發展，起到抑癌或促癌的作用[11]。

Liu等[12]發現miR-502處理或下調Set8可抑制乳腺癌細胞增殖和細胞周期，減少細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化，臨床分析顯示，miR-502在乳腺癌腫瘤組織中的表達低于癌旁組織。HDAC3屬于Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶，而類組蛋白去乙?；缚纱呋磉^程中的關鍵蛋白。已有研究證實HDAC3在乳腺癌組織中表達水平高于正常組織，并與乳腺癌患者淋巴結轉移及預后密切相關[8]。本研究通過網站預測了miR-502、HDAC3之間存在一定的靶向關系，但需實驗驗證。

本研究結果顯示，乳腺癌組織中miR-502表達水平顯著低于癌旁組織，而HDAC3表達趨勢與之相反。這與Liu等[12]及林俊杰等[8]報道一致。說明乳腺癌組織中miR-502表達水平下調，HDAC3表達上調，分析原因：①在多種惡性腫瘤組織中，miR-502起到抑癌基因的作用，而HDAC3起到促癌基因的作用，因此在乳腺癌組織中，促癌基因發揮主要調控作用，抑癌基因表達受到抑制；②HDAC3表達上調可能受到乳腺癌組織中miR-502的靶向負調控的影響。結果顯示，二者呈負相關，且HDAC3是miR-502的直接靶基因，由此推測miR-502通過靶向負調控HDAC3參與乳腺癌病情的發生發展。

本文結果顯示miR-502、HDAC3表達水平與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移及ER/PR表達情況有關。TNM分期是乳腺腫瘤大小及其是否出現轉移的重要體現，而TNM分期Ⅲ～Ⅳ期腫瘤組織中miR-502低表達及HDAC3高表達比較多，說明miR-502可能通過靶向負調控HDAC3抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移。當ER或PR呈陰性表達時，說明激素已經不能起到治療乳腺癌的作用，反應乳腺癌的惡化程度較顯著[13-14]。這說明隨著乳腺癌病理分級及病情的惡化，miR-502呈下調趨勢，HDAC3呈上調趨勢，其中HDAC3病理分析結果與Zhao等[15]研究類似。

本文結果顯示，miR-502、HDAC3及二者聯合針對乳腺癌患者具有較好的診斷價值，miR-502高表達組患者的3年總生存率高于miR-502低表達組；HDAC3表達趨勢與之相反。結果說明患者癌組織中若miR-502呈低表達及HDAC3呈高表達，可一定程度反應患者預后不良，進一步提示miR-502及HDAC3可能成為乳腺癌治療的靶標因子。

綜上，miR-502在乳腺癌組織中呈低表達水平，HDAC3呈高表達水平，HDAC3是miR-502的直接靶基因，二者之間呈負相關，且與患者病情發展及預后相關，可作為早期診斷乳腺癌的生物學指標。