循環腫瘤細胞分型檢測及其在晚期肺癌中的臨床應用研究

周 政,孟凡萍,趙 丹,牛曉昶,范 慧,李思穎,康菊香,趙 昕

重慶大學附屬三峽醫院檢驗科，重慶 404000

肺癌是我國發病率、病死率最高的癌癥，每年有超過78萬新發病例[1]。確診時間晚、發生遠處轉移是肺癌整體生存率較低的兩大主要原因[2]。肺癌已成為我國主要的公共衛生問題[3-4]。盡管現代醫學在肺癌的診治方面取得了重大進展，但肺癌的5年生存率仍低[5]。早期診斷、早期治療以提高肺癌長期生存率仍然任重而道遠。外周血循環腫瘤細胞(CTCs)是自發或因診療操作(手術、穿刺等)從實體腫瘤的原發灶或轉移灶脫落進入外周循環或淋巴系統的腫瘤細胞，是研究腫瘤轉移生物學行為的實時活檢標本。CTCs可在腫瘤發生、發展的各個階段檢測到，血液標量為7.5 mL時，其陽性率為30.4%(38/125)～52.9%(18/34)[6-7]。CTCs有3個亞群，即上皮型、間質型、混合型[8]。在腫瘤發展過程中，循環系統中的CTCs會經歷上皮-間質轉化(EMT)，即上皮表達減少、間質表達增加，導致細胞結構發生變化，細胞黏附力降低，從而促進腫瘤細胞遷移和浸潤[9-10]。CTCs是導致惡性腫瘤患者腫瘤復發及發生遠處轉移的重要因素，與腫瘤診斷及疾病狀態緊密相關。盡管外周血中CTCs的數量相對于血細胞而言，極其稀少(1～10億個單核血細胞里可以找到1個CTCs)[11-12]，但隨著檢測技術突飛猛進的發展，CTCs檢測已經發展成一種新興的非侵入性的臨床輔助診斷方法。結合影像學或病理學檢查結果可更綜合地評估患者療效及預后，實現對腫瘤術后復發、轉移及時有效的管理。本研究探討了晚期肺癌患者外周血CTCs的數量及分型與患者臨床特征之間的關系，旨在為CTCs檢測的臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 以本院2018年2月至2019年11月診斷的43例初治或復治的原發性晚期(Ⅲ期及Ⅳ期)肺癌患者納入研究組。其中男22例，女21例；年齡49～72歲，中位年齡60.8歲。根據修訂的世界衛生組織(WHO)分類法和國際肺癌研究協會(IASLC)的第八版TNM分期建議，結合臨床資料確定入組的晚期肺癌患者[13]。收集患者的一般特征(年齡、性別、吸煙史、是否為初治)和臨床特征(腫塊位置、肺葉分布、臨床分期、病理亞型、器官轉移狀況)。在患者進行手術或治療之前，行胸部CT、骨掃描、頭顱MRI、腹部彩超或全身PET/CT影像學檢查，并采集患者的外周血標本。另選擇同期本院健康體檢者31例作為對照組，其中男19例，女12例；年齡45～71歲，中位年齡59.7歲。兩組研究對象年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器：CanPatrol?CTCs(益善生物公司)；Axio Observer A1熒光顯微鏡(德國Zeiss)；恒溫孵育箱(Thermo Fisher 3111)；KDC60低速離心機(中科中佳公司)；QY-31真空抽濾機(上海岐耀公司)。主要試劑：人CTCs分型檢測試劑盒[多重信使RNA(mRNA)原位分析法(益善生物)]；紅細胞裂解液；4%甲醛溶液；磷酸鹽緩沖液(PBS)；洗滌液(0.1×SSC)；前置擴增溶液(30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸、3 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、0.5 fmol的前置序列)；擴增溶液(30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸、3 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、1.0 fmol的擴增序列)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)；蛋白酶。除蛋白酶購自Qiagen公司外，其余試劑購自Sigma公司。

1.3方法

1.3.1采樣 使用真空采血系統(EDTA-K2抗凝管)采集患者5 mL外周血，立即輕柔顛倒混勻8次，防止凝血。不能及時進行制模可于2～8 ℃保存，預處理需在標本采集后4 h內完成。

1.3.2制膜 進行CanPatrol?CTCs檢測前，先將紅細胞裂解，步驟如下：(1)將抗凝血轉移至標本保存管于室溫靜置30 min；(2)1 850 r/min(600×g)低速離心5 min后棄上清液；(3)加入4 mL PBS和1 mL RI固定劑混勻，靜止8 min后轉移至過濾柱；(4)采用真空泵(負壓0.06 MPa)進行抽吸，使細胞吸附于濾膜；(5)于過濾器中加入1 mL 4%甲醛溶液，固定1 h后棄溶液；(6)依次加入1 mL 50%、70%、100%乙醇溶液，分別室溫靜置2 min后完成細胞濾膜制備。

1.3.3雜交 取下濾膜進行如下操作：親水、透化、消化、探針雜交、預擴增、擴增、顯色、復染。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3.4鏡檢 于-20 ℃或室溫直接鏡檢：采用全自動熒光顯微鏡染色體分析系統軟件，首先進行20倍鏡下預掃，而后于40倍鏡下進行細胞核型拍攝及熒光拍攝，最后進行圖片導出。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件分析數據。非正態分布的計量資料以M(P25～P75)表示，多組間比較行Kruskal-WallisH非參數檢驗，兩組間比較行Man-WhitneyU非參數檢驗;計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CTCs表性特征 經CanPatrol?CTCs平臺，將43例晚期肺癌患者的外周血CTCs分離出來，并分為上皮型、間質型、混合型3種亞型。患者外周血CTCs的表型特征如圖1所示，其中深色熒光(圖1A中全部斑點及圖1B中對比度稍暗的斑點)標記的是上皮分子標志物(EpCAM及cytokeratin8/18/19)，淺色熒光(圖1C中全部斑點及圖1B中對比度更亮的斑點)標記的是間質分子標志物(Vimentin及Twist)。

注：A為上皮型CTCs；B為混合型CTCs；C為間質型CTCs。

2.2CTCs檢出情況 CTCs的檢出范圍為2～49個，中位數為13個；上皮型CTCs的檢出范圍為0～13個，中位數為2個；混合型CTCs的檢出范圍為0～31個，中位數為8個；間質型CTCs的檢出范圍為0～33個，中位數為2個。43例患者全都檢出CTCs，陽性率為100.0%；上皮型CTCs、混合型CTCs和間質型CTCs的陽性患者分別是33例、42例和34例，陽性率分別為76.7%、97.7%和79.1%。此外，43例晚期肺癌患者中，31例(72.1%，31/43)以混合型CTCs為主。混合型CTCs在數量和陽性率上相較于上皮型CTCs和間質型CTCs更高，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組均未檢出CTCs，與研究組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3CTCs與患者一般特征的關系 總CTCs和各亞型CTCs在患者的一般特征(年齡、性別、吸煙史、是否為初治)間的差異無統計學意義(P>0.05)，提示總CTCs數量及不同表型CTCs的數量與晚期肺癌患者的年齡、性別、吸煙史以及是否為初治均無關。見表1。

表1 CTCs與患者一般特征的關系[M(P25～P75)，個]

2.4CTCs與患者臨床特征的關系 總CTCs和各亞型CTCs在患者各臨床特征(腫塊位置、肺葉分布、臨床分期、病理亞型)間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CTCs與患者臨床特征的關系[M(P25～P75)，個]

2.5CTCs與患者器官轉移的關系 由于CTCs與腫瘤的轉移特性密切相關，因此將腫瘤的器官轉移分為肺內轉移(同側肺轉移、對側肺轉移)和肺外轉移(臟器轉移、骨轉移、腦轉移)，以進一步探討不同器官轉移與CTCs數量及亞型的關系。在本研究中，共30例晚期肺癌患者發生了器官轉移，占69.8%(30/43)。這30例患者的總CTCs、上皮型CTCs、混合型CTCs和間質型CTCs數量分別為12.50(7.00～20.75)、2.00(1.00～4.00)、7.50(3.00～14.00)、2.00(1.00～5.00)個。

有肺外轉移的患者與無肺外轉移的患者：上皮型CTCs的數量分別為1.00(0.00～2.00)個和0.00(0.00～0.50)個，差異有統計學意義(P<0.05)；混合型CTCs的數量分別為3.00(2.50～8.50)個和2.00(2.00～2.50)個，差異有統計學意義(P<0.05);二者總CTCs數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。總CTCs數量和各亞型CTCs數量在其他分組中的差異均無統計學意義(P>0.05)。但值得注意的是，對于有臟器轉移或骨轉移(椎骨更易出現轉移灶，尤其是胸椎)的患者，其總CTCs、上皮型CTCs、混合型CTCs和間質型CTCs數量均多于無臟器轉移或骨轉移的患者。見表3。

表3 CTCs與患者器官轉移的關系[M(P25～P75)，個]

續表3 CTCs與患者器官轉移的關系[M(P25～P75)，個]

3 討 論

為了有效地分離和檢測CTCs，大量新技術和新方法被研發出來，但都未能突破只能單標記CTCs或檢測上皮型CTCs的局限，因而實現對各表型CTCs的同時檢測是一個技術方面的難題[14]。而CanPatrol?CTCs分型檢測技術不僅實現了對外周血CTCs的快速分離，還實現了對各種表型CTCs的同時檢測。其細胞采集系統的高效性依賴于納米級濾膜的使用；此外，該技術選用特異性mRNA標志物(EpCAM、CK、Vimentin、Twist等)作為原位檢測的靶標，相較于以往使用蛋白靶標的CTCs檢測技術，該技術對CTCs的檢出時間更早，檢測特異性更高[15]。

本研究中43例晚期肺癌患者均檢出CTCs，其中混合型CTCs陽性率最高，72.1%(31/43)的患者以混合型CTCs為主，表明混合型CTCs的檢出與晚期肺癌具有相關性，與文獻[16]報道結果一致。但其對于早、晚期肺癌的鑒別診斷作用還需要進一步收集早期肺癌患者進行對比分析。此外，晚期癌癥以混合型CTCs為主的現象也見于結直腸癌等其他癌癥[17]。

發生器官轉移的患者有30例，其中發生肺外轉移的患者所對應的混合型CTCs與上皮型CTCs，與未發生肺外轉移的患者相比，差異有統計學意義(P<0.05)，總CTCs數量也多于未發生肺外轉移的患者(P<0.05)。CTCs脫離原發病灶后只有極少數能到達定植器官形成轉移灶，而轉移、定植后的CTCs增殖能力依賴于上皮型標記物的表達。在CTCs發生EMT后細胞凋亡受到抑制，表型與外周間質成分極其相似，免疫系統不易識別，進而可逃避免疫系統的攻擊[18]。混合型CTCs與上皮型CTCs相比，有更強的轉移能力，與間質型CTCs相比，有更強的增殖能力，因此，混合型CTCs能有效地播散及增殖，形成轉移灶[19-20]。

發生肺外轉移的患者共27例，發生腦轉移的患者數量最多(16例)，其次是骨轉移(13例)和臟器轉移(6例)。腦是CTCs肺外轉移最常定植的器官，其次是骨骼(尤其是胸椎)。HANSSEN等[21]研究表明，出現腦轉移的非小細胞肺癌(NSCLC)患者外周血中的總CTCs可作為預后評估的參照。也有研究表明，腦可作為轉移儲存庫，但骨是CTCs最常寄居的部位，是最常見的儲存庫[22]。本研究發現，在骨轉移的13例患者中，不同的骨形成轉移灶的潛力是不同的，其中椎骨更易出現轉移灶(尤其是胸椎)。此外，在發生臟器轉移的6例患者中，3例為肝轉移，3例為腎轉移。對于轉移的偏好和傾向性，還需要進一步收集相關病例進行探討。

在43例晚期肺癌患者中，Ⅳ期肺癌患者的總CTCs、混合型CTCs和間質型CTCs數量均多于Ⅲ期患者，且總CTCs數隨晚期肺癌分期的升高而呈升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。KREBS等[23]研究證明，Ⅳ期NSCLC患者的總CTCs數明顯多于Ⅲa期和Ⅲb期患者。孫雯雯等[16]研究顯示，在N分期中，N3期的上皮型CTCs數多于N2期，但N0期的上皮型CTCs數多于N2期；在M分期中，M1c期的上皮型CTCs數多于M0期和M1a期。而本研究數據顯示，在T分期中，T3期的總CTCs數多于其他不同分期的間質型CTCs；在N分期中，N2期的總CTCs數多于其他不同分期；在M分期中，M1b期的混合型CTCs數多于其他所有亞型。

本研究中入組的肺癌包括肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌3種病理亞型，各病理亞型的總CTCs數和各亞型CTCs的數量差異均無統計學意義(P>0.05)。HUANG等[24]薈萃分析結果表明，CTCs數量與腫瘤分期和淋巴結轉移呈正相關，而與病理分型無關。CHEN等[25]對肝細胞癌CTCs的研究結果也顯示，發生EMT的CTCs數量和亞型與對應的病理分型無關。

綜上所述，CTCs在晚期肺癌患者的外周血中具有較高的檢出率，尤其是混合型CTCs，可作為晚期肺癌轉移評估的輔助判斷指標。CTCs分型檢測對于探討CTCs轉移的器官偏向性也具有重要價值。CTCs檢測技術屬于非侵入性檢測手段，可連續動態監測患者術后CTCs數量和比例變化，持續觀察患者的疾病進展，推動晚期肺癌的精準診療進程。