唐山地區CRE產新德里金屬β-內酰胺酶亞型情況分析*

楊紅梅，張淑青，劉 麗，白 靜，孫 靜，張巧玲，張晉玲，袁寶軍△

開灤總醫院:1.檢驗科；2.藥劑科,河北唐山 063000；3.河北省唐山市玉田縣醫院檢驗科,河北唐山 064100

腸桿菌科細菌是臨床常見的條件致病菌，可引起多個部位感染。碳青霉烯類藥物抗菌譜廣，是治療產超廣譜β-內酰胺酶或Ampc酶腸桿菌科細菌的首選用藥，但是隨著此類藥物大量及不當使用，碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌(CRE)開始出現，且耐藥率呈逐年上升趨勢。由于CRE的治療藥物有限，患者病死率高，CRE已經嚴重威脅人類健康[1-3]。CRE的耐藥機制包括產碳青霉烯酶、產超廣譜β-內酰胺酶或Ampc酶合并膜孔蛋白缺失或突變、外排泵的存在。產酶是CRE的主要耐藥機制。碳青霉烯酶分A、B、D 3類，A類和D類碳青霉烯酶其活性部位均需要絲氨酸,而B類金屬酶需要鋅來進行水解。新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)屬于碳青霉烯酶中的B類金屬酶，可以水解除氨曲南以外的β-內酰胺類抗菌藥物。含此酶的細菌幾乎對所有抗菌藥物耐藥，β-內酰胺酶抑制劑如舒巴坦、克拉維酸等也不能有效抑制該類金屬酶[4]。NDM被報道以來，產NDM的耐藥菌已在全世界廣泛流行，NDM正在快速地演化，已出現NDM-17亞型的報道[5]。blaNDM是一種質粒攜帶的碳青霉烯耐藥基因，可在各種病原體中廣泛傳播[6]，給臨床抗感染治療帶來極大困難。不同地區在自然環境、經濟條件、衛生條件及抗菌藥物的使用等方面不同，這些因素都可能導致產NDM耐藥菌的地區分布存在差異。本研究通過對唐山地區CRE進行blaNDM基因檢測，了解本地區blaNDM基因的流行情況及流行趨勢，為臨床治療和防控提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 連續收集唐山地區規模較大的3所三級甲等綜合醫院2018-2019年臨床分離的CRE非重復菌株252株。CRE判定依據美國臨床實驗室標準化協會 (CLSI)M100-S30標準，對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南)任意一種非敏感。藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705為陽性對照，ATCC BAA-1706為陰性對照。blaNDM陽性對照株為經DNA測序確認的大腸埃希菌。

1.2儀器與試劑 培養箱(Thermo Scientific)、Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)、Bio-Rad PCR儀、電泳儀、Bioshine GelX 1850 凝膠成像儀(上海歐翔科學儀器公司)、藥敏紙片(Oxoid公司)、M-H培養基(溫州康泰生物科技有限公司產品)、乙二胺四乙酸(EDTA,索萊寶)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB，上海博微生物科技有限公司)、DNA提取試劑盒(北京天根公司)、引物合成(北京擎科生物科技有限公司)、2×Taq MasterMix (北京擎科生物科技有限公司)、DNA標志物(北京擎科生物科技有限公司)、替加環素E-test試條(法國生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定 采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行試驗。

1.3.2碳青霉烯酶表型篩選試驗 采用改良碳青霉烯類滅活試驗(mCIM)和EDTA協同改良碳青霉烯類滅活試驗(eCIM)對CRE是否產酶以及產酶型別進行確證：取兩管2 mL TSB肉湯,1管為mCIM試驗管，另1管加入20 μL的0.5 mol/L EDTA溶液(終濃度為5 mmol/L)作為eCIM試驗管。用1 μL接種環刮取滿環血平板上過夜培養的受試菌株,分別加入上述兩管TSB肉湯中,震蕩混勻。將美羅培南紙片(10 μg) 浸入菌懸液中，35 ℃溫育4 h。制備0.5麥氏濁度單位大腸埃希菌ATCC25922菌懸液并均勻涂布M-H瓊脂平板。用10 μL接種環將美羅培南紙片取出并擠去多余菌液,貼至上述M-H瓊脂板上,同一受試菌mCIM和eCIM試驗管中的美羅培南紙片貼于同一M-H平板，35 ℃溫育18～24 h,量取抑菌圈直徑進行結果判斷，藥敏試驗結果參照CLSI 2018年版的標準判讀。

1.3.3耐藥基因檢測 采用DNA提取試劑盒提取細菌DNA，PCR擴增碳青霉烯酶基因NDM。參考文獻[7]設計NDM引物，引物序列上游為5′-GGG CAGTCGCTTCCAACGG-3′，下游為5′-GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT-3′，由北京擎科公司合成。PCR反應體系總體積25.0 μL，包括DNA模板3.0 μL，相應上、下游引物(50 μmol/L)各0.2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.1 μL。94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火延伸30 s，72 ℃延伸45 s ，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像與分析系統觀察結果，PCR擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司進行測序，測序采用雙向。測序結果用BLAST與GenBank已知序列比對以確定其基因型。

2 結 果

2.1mCIM和eCIM結果 252株CRE中245株mCIM陽性，7株陰性，PCR結果顯示有243株含碳青霉烯酶，這些菌株mCIM均為陽性。mCIM靈敏度為100.0%,特異度為77.8%。252株CRE中75株eCIM陽性，177株陰性。76株產NDM的菌株mCIM均為陽性，74株eCIM為陽性。eCIM靈敏度為97.4%,特異度為99.4%。見表1～2。

表1 mCIM與PCR檢測結果(n)

表2 eCIM與PCR檢測結果(n)

2.2產NDM菌株的標本來源 76株產NDM菌株的標本類型主要是痰液(44.74%)，其次尿液(30.26%)、分泌物(13.16%)。產NDM-1菌株主要分離自呼吸道，產NDM-5菌株主要分離自泌尿系統和呼吸道。見表3。

表3 產NDM菌株標本類型分布[n(%)]

2.3NDM亞型及菌種分布 252株CRE經PCR擴增后發現76株含有blaNDM基因，NDM-5占60.53%(46株)、NDM-1占36.84%(28株)、NDM-9占2.63%(2株)。76株產NDM的腸桿菌科細菌中包括大腸埃希菌38株，占比最高，其他依次為肺炎克雷伯菌(29株)，產酸克雷伯菌(6株)，陰溝腸桿菌(3株)。見表4。

表4 NDM亞型及菌種分布[n(%)]

2.4藥敏試驗結果 僅發現2株CRE對替加環素耐藥，1株為NDM-5，1株為NDM-9。產NDM菌株對氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑的耐藥率分別為77.6%、77.6%、89.5%、82.9%；產NDM-5菌株對氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑的耐藥率分別為84.8%、82.6%、93.5%、89.1%；產NDM-1菌株對氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑的耐藥率分別為64.3%、67.9%、82.1%、82.1%。發現4株產NDM-5菌株對美羅培南敏感，產NDM-9菌株除了替加環素外，對其他藥物全部耐藥。見表5。

表5 NDM及其亞型的耐藥率[%(n/n)]

續表5 NDM及其亞型的耐藥率[%(n/n)]

2.5部分產NDM菌株典型電泳圖 對76株攜帶耐藥基因blaNDM的腸桿菌科細菌進行具體分型后發現，其中28株為blaNDM-1，46株為blaNDM-5，2株為blaNDM-9。見圖1。

注：M為標志物；Neg為陰性對照；Pos為陽性對照；方框選取的第5、8、10泳道為陽性菌株，相對分子質量為782 bp。

3 討 論

產碳青霉烯酶是CRE的主要耐藥機制。我國流行的碳青霉烯酶主要是KPC-2酶，NDM型碳青霉烯酶的檢出率近幾年呈上升趨勢。2012—2016年，NDM的檢出率迅速增加，從12%上升到28%[8]。ZHANG等[9]通過對中國25個地區1 105株CRE進行調查，發現CRE中產NDM的占比是32%。本研究從252株CRE中檢測出76株產NDM菌株，NDM占比為30.16%(76/252)，與ZHANG等[9]的報道接近。

本研究252株CRE中245株mCIM陽性，75株eCIM陽性。表型篩選試驗與PCR結果一致性較高，靈敏度、特異度高于相關報道[10]。76株產NDM的CRE涉及4個菌種，以大腸埃希菌為主，其次是肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌。不同菌種攜帶的亞型不同，大腸埃希菌主要攜帶NDM-5，肺炎克雷伯菌主要攜帶NDM-1。產NDM菌株來自臨床多種類型標本，可引起患者多個部位的感染，因此陽性菌株患者一定要及時隔離，做好多重耐藥菌的防治措施，避免CRE進一步擴散。呼吸道是主要檢出途徑，其次是泌尿系統。同時，不同標本來源的NDM亞型分布不同，呼吸道主要攜帶的是NDM-1，其次是NDM-5,泌尿系統則主要是NDM-5。

本研究證實唐山地區NDM亞型主要是NDM-5和NDM-1，僅發現2株NDM-9。這與楊勇文等[11]報道的武漢地區流行的NDM亞型不同，證實NDM亞型的分布具有地域性區別。46株產NDM-5的菌株中，30株為大腸埃希菌，11株為肺炎克雷伯菌，NDM-5主要存在于大腸埃希菌中。這提示可以通過CRE的菌種推測NDM亞型，提前做好防控對策，避免疾病的暴發、流行。NDM-5是NDM-1的變異體，由NDM-1的兩個氨基酸發生改變進化而來，首次在大腸埃希菌中檢出[12]。CHEN等[13]在2016年通過對中國4個區域上并無關聯的城市研究發現，NDM-5在我國各地廣泛傳播，彼此間并無關聯，既可以引起院內感染，也可以引起社區感染。NDM-1共檢出28株，涉及3個菌種，以肺炎克雷伯菌為主。NDM-9只檢出2株，由分離自痰液標本的陰溝腸桿菌攜帶。NDM-9對β-內酰胺類抗菌藥物，尤其是碳青霉烯類抗菌藥物的親和力、水解能力更高，這與以往報道一致[14]。有研究報道，從環境中分離出此亞型，說明此亞型傳播范圍更廣，要做好預防措施[15]。

76株攜帶NDM的CRE耐藥性嚴重，除了對氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑部分敏感外，對其余抗菌藥物幾乎全部耐藥。NDM屬于碳青霉烯酶中的金屬酶，金屬酶不能有效水解氨曲南，通過對本地區CRE進行藥敏試驗分析發現，氨曲南呈高水平耐藥，可能產NDM菌株同時攜帶其他β-內酰胺類耐藥基因如blaTEM、blaSHV、blaCTX等[16]。本研究中NDM-1和NDM-5亞型間耐藥性存在差異，NDM-9菌株較少不納入比較。有研究指出，NDM-5攜帶的V88L使NDM-5酶的活性增強，對碳青霉烯類藥物的最小抑菌濃度(MIC)值是NDM-1的4～8倍[17]，此外，NDM-5常攜帶多種耐藥基因[18]，因此NDM-5的耐藥性更強。本研究中NDM-5耐藥率高于NDM-1，這與已有的報道一致[19]。因此。臨床應高度關注產NDM-5菌株。目前針對CRE的治療多采用聯合用藥，尤其是以碳青霉烯類藥物為基礎的聯合用藥[20]，本研究發現該菌對阿米卡星、妥布霉素的耐藥率相對較低，而替加環素靈敏度更高，均可作為聯合用藥的選擇。

綜上所述，唐山地區CRE產生的NDM有3種不同的亞型,以NDM-5和NDM-1為主，主要由大腸埃希菌攜帶，感染途徑主要是呼吸道和泌尿系統。唐山地區NDM亞型呈多樣性變遷且耐藥性嚴重，臨床應高度關注。