牡荊提取物主要化學成分分析及自由基清除能力

向 蓉，舒柄垚，高 原，李亞暉，魏光偉,2，唐興剛,2，郭偉干,2，羅勝軍,2*

(1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東省中獸藥工程技術研究中心，廣東 廣州 510640；2.廣東省前沿動物保健有限公司,廣東 廣州510550；3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000；4.珠海市啟信達生物科技有限公司，廣東 珠海 519000)

2019年農業農村部第194號公告正式發布，規定自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，正式開啟了我國飼料禁抗新紀元。因此，尋找飼用抗生素的高效替代產品成為目前當務之急。天然植物因具有多種活性物質和營養成分，能全面調節機體的生理功能[1-3]、提高動物生產性能[4-5]、增強機體免疫力[6-7]、提高飼料轉化率[8]，且有天然環保無殘留，毒副作用小等優點[9]，在養殖中已有大規模使用，成為替抗產品最佳選擇之一[10]。

牡荊(Vitexnegundo L.var.cannabifolia(Sieb.et Zucc.) Hand.-Mazz.)是一種傳統的藥用植物，屬于馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊屬(Vitex)。人們對牡荊屬其他植物如蔓荊、黃荊、穗花牡荊等進行了大量研究，發現牡荊屬植物大多具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[11-14]。但是目前對牡荊的研究報道較少，已有報道大多集中于對牡荊子的化學成分和生物活性的研究上[15]，而對于牡荊枝、葉的基礎研究及其應用的報道還較少。牡荊的開發利用主要集中在人醫，由牡荊葉提取的揮發油制成的油膠丸已載入中國藥典[16]，但在獸醫領域的應用還是一片空白。本課題組在前期動物試驗基礎上發現牡荊提取物有較好的抗腹瀉作用。鑒于此，本研究利用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS)技術對牡荊水提物和醇提物進行化學成分分析，并通過DPPH自由基清除能力測試評價兩種提取物的抗氧化能力。以期了解其主要活性成分及體外抗氧化能力，為牡荊作為中獸藥及飼料添加劑在養殖業中進一步開發利用提供基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑牡荊采自廣東省廣州市，經華南農業大學郭世寧教授鑒定為馬鞭草科牡荊屬植物牡荊。藥材采集后切成小段，經50℃烘干后，用中藥粉碎機粉碎成粗粉，過20目篩，備用；無水乙醇(分析純A.R.)、抗壞血酸(Vc)均購自國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器和設備離子淌度-Q-TOF高分辨液質聯用儀(Synapt G2-Si),美國Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm),美國Waters公司；酶標儀(EL×800)，美國BioTek公司；超純水系統(Moldene 1820a)，重慶摩爾實驗儀器有限公司。

1.3 牡荊提取物的制備牡荊水提物的制備：稱取5 g牡荊粉于圓底燒瓶中，加入50 mL超純水(料液比1∶10)，加熱煮沸回流提取1 h后抽濾，收集濾液并再次向濾渣中加入50 mL超純水煮沸1 h，合并2次濾液定容至100 mL，4℃保存待用。

牡荊醇提物的制備：稱取5 g牡荊粉于圓底燒瓶中，加入50 mL 不同濃度乙醇煮沸回流提取1 h，抽濾后再次向濾渣中加入50 mL 相同濃度乙醇提取1 h，合并2次濾液定容至100 mL，4℃保存待用。乙醇濃度分別采用95%，80%，70%，60%，50%，獲得對應濃度的醇提物。

1.4 DPPH自由基清除試驗溶液的制備待測溶液的制備：用水和無水乙醇分別稀釋牡荊水提液和醇提液，水提液分別稀釋至生藥質量濃度為1.500，1.000，0.500，0.250，0.125 g/L；95%醇提液分別稀釋到5.000，4.000，3.000，2.000，1.000 g/L；80%醇提液分別稀釋到3.000，2.500，2.000,1.000,0.500 g/L；70%醇提液、60%醇提液、50%醇提液均稀釋至2.000，1.500，1.000，0.500，0.250 g/L。

DPPH溶液的制備：精密稱取4.000 mg DPPH粉末，用無水乙醇溶解定容至10 mL，得質量濃度為0.400 g/L的DPPH母液，4℃避光保存備用；使用時以無水乙醇稀釋為0.080 g/L的工作液。

Vc溶液的制備：精密稱取8.000 mg Vc，用無水乙醇溶解制成0.800 g/L的Vc母液，依次用無水乙醇稀釋為質量濃度分別為0.020，0.015，0.010，0.005，0.002 g/L的Vc對照液。

1.5 液相色譜條件以0.1%甲酸水溶液為流動相(A)，以0.1%甲酸乙腈為流動相(B)，梯度洗脫為0～1.0 min，2% B；1.0～25.0 min，98%～5% B；25.0～32.0 min，5% B；32.0～32.2 min，5%～98% B；32.2～35.0 min，98% B。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，梯度洗脫(A.水；B.乙腈,均含0.1%甲酸)

1.6 質譜條件電離方式：+/- ESI離子掃描模式；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：35 V；源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；氣簾氣：40 L/h；脫溶劑氣：750 L/h；霧化氣：6.500 Bar。

1.7 DPPH自由基清除試驗試驗方法參考文獻[17]，以Vc為陽性對照組，在96孔板中分別加入不同濃度的牡荊提取液稀釋液和100 μL DPPH自由基工作液，每個濃度設置3個復孔。將96孔板放入酶標儀中振蕩1 min后室溫、避光靜置30 min，在517 nm處測定D值，計算各組自由基清除率，并計算IC50值。

清除率(%)=[1-(D樣品-D本底)/D空白] ×100%

D樣品為供試品與DPPH反應后的吸光度值；D本底為供試品中未加 DPPH反應液時的吸光度值；D空白為溶劑與DPPH反應后的吸光度值。

2 結果

2.1 UPLC-MS分析結果本研究對牡荊70%醇提液和水提液進行了UPLC-MS分析，采用正負離子掃描模式，其正、負離子流圖分別如圖1，2所示。

A.牡荊醇提液離子流圖;B.牡荊水提液離子流圖

A.牡荊醇提液離子流圖;B.牡荊水提液離子流圖

通過對一級質譜數據進行分析，在醇提液和水提液中共檢測出77種化合物的信息，其中水提液和醇提液共有的化合物有44種，醇提液獨有的有22種，水提液獨有的有11種。

2.2 牡荊提取物主要化學成分分析結合二級質譜數據、MassBank數據庫以及參考文獻等，共確定22種化合物的結構信息，主要包括酚酸類、黃酮類以及環烯醚萜類等化合物。如表1所示，其中黃酮類化合物有11種(表1中8～12，14，17，19～22)，酚酸類化合物有8種(表1中2～3，5～7，15～16，18)，環烯醚萜類3種(表1中1，4，13)。

表1 牡荊提取液中化合物離子結構信息

續表1

續表1

2.3 DPPH自由基清除能力評價不同濃度的牡荊水提液及醇提液均具有一定的DPPH自由基清除能力，IC50結果如表2所示。牡荊醇提液的IC50值隨提取時醇濃度的升高反而降低，而牡荊水提液清除DPPH自由基的IC50值為生藥質量濃度0.860 g/L，顯著低于牡荊醇提液，說明牡荊水提液的抗氧化能力強于醇提液。

表2 不同牡荊提取液對DPPH自由基清除能力

3 討論

牡荊屬植物大多為藥用植物，具有多種活性成分。李春正等[18]對國內外牡荊屬植物的化學成分進行綜述，已從牡荊屬植物中分離出206種化合物。近年來國內外關于牡荊屬植物化學成分的研究報道也越來越多，該屬植物新發現了多種化合物。徐堯等[19]從蔓荊子乙醇提取物中分離得到15個化合物，其中(E)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羥基二苯乙烯、(8R)-evofolin B、覆盆子酮、芐基-β-D-葡糖苷、云杉苷和4-(4′-羥基苯基)-2-丁酮-4′-O-β-D-吡喃葡糖苷為首次從牡荊屬植物中分離得到。NIU等[20]在荊條葉70%醇提物中分離鑒定出10種環烯醚萜類化合物，其中化合物1號nishindacin A和2號isonishindacin A 為新發現的環烯醚萜類化合物。SICHAEM等[21]從荊條葉中分離出vitexnegundin，牡荊內酯，vitetrifolin D等9種化合物，其中vitexnegundin為一種新的半日花烷型二萜類化合物。但是目前對牡荊的相關研究大多集中于牡荊子的化學成分和生物活性，而對于牡荊枝、葉的基礎研究及其應用的報道還較少。本研究基于液質聯用技術對牡荊化學成分進行分析，從牡荊細枝和葉的不同溶劑提取液中共分離出77種化合物，鑒定出了其中22種化合物的結構，主要有黃酮類、酚酸類和環烯醚萜類等物質，牡荊醇提液和水提液均含有這幾類物質，但從總離子流圖來看牡荊水提液中總的物質種類少于醇提液。從已比對出的疑似化合物成分看，牡荊中含有較多的黃酮類和酚酸類化合物，以牡荊素為代表的黃酮類化合物能顯著提高動物生產性能，提高動物機體抗病力，改善動物機體免疫機能。酚酸類化合物主要是綠原酸及其衍生物。綠原酸已被報道是一種具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒、降糖降脂等多種功能的生物活性物質[22]，應該在牡荊的生物學功能中發揮重要作用。因受參考文獻和查閱數據庫的限制，本研究中比對出的疑似化合物數量有限，其余成分的確定有待進一步分析，單體化合物的驗證也需要下一步試驗。

利用天然植物提取物作為體外抗氧化劑已成為食品、化工、醫藥等領域的研究熱點。目前大量研究發現酚酸類[23]、黃酮類[24]、皂苷類[25]、多糖類[26]等化合物均具有較好的抗氧化活性。本研究以DPPH法研究牡荊不同濃度醇提液和水提液的抗氧化活性。發現不同濃度的牡荊醇提液和牡荊水提液均具有一定的抗氧化活性，牡荊水提液具有較好的清除DPPH自由基的能力，其IC50值為生藥質量濃度0.860 g/L。醇提液清除DPPH自由基的能力顯著低于水提液，且隨著醇濃度的升高而降低。這說明牡荊中主要的抗氧化活性物質更適合水提方法進行提取。從前述化學成分研究發現酚酸類、黃酮類物質是其主要活性成分，大量的研究也證實酚酸類物質如綠原酸、黃酮類物質均具有較好的抗氧化活性。

本研究對牡荊中的化學成分及其抗氧化能力進行初步分析，有助于了解其潛在的生物活性，同時為其后續的進一步研究利用提供物質成分方面的基礎支撐。