不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛家兔治療作用及機(jī)理探究

王忠清，楊顯朝，劉 娟,2*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.西南大學(xué) 免疫學(xué)研究中心，重慶 榮昌 402460；3.重慶市萬州區(qū)茨竹鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，重慶 萬州 404100)

現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖方式使得畜禽活動(dòng)受到嚴(yán)格限制，畜禽會(huì)因久臥或久坐而傷及脾胃，故脾虛證在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)病率較高。脾虛證主要表現(xiàn)為消化不良或腹瀉，嚴(yán)重影響著畜禽的生產(chǎn)性能[1]。機(jī)體消化功能與胃腸激素的分泌有著密切聯(lián)系[2]，胃腸激素中的胃泌素(gastrin,GAS)和胃動(dòng)素(motilin,MTL)分別能通過刺激胃酸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)來促進(jìn)胃腸消化吸收[3]。此外，脾虛證動(dòng)物也會(huì)因?yàn)榧?xì)胞免疫因子的分泌紊亂，繼而出現(xiàn)免疫功能下降的現(xiàn)象[4-5]。研究表明，脾虛證家兔細(xì)胞免疫功能降低的原因可能與血液中T淋巴細(xì)胞比例下降有關(guān)[6]；而活化的T淋巴細(xì)胞所分泌的IL-2、IL-4、IFN-γ是維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要因子[7]。而且環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，cAMP/cGMP的平衡也對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞能量代謝發(fā)揮著重要作用[8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，黨參及其炮制品(米黨參和蜜黨參)均能有效治療家兔脾虛證[9]。中獸醫(yī)臨床上治療脾虛證，宜補(bǔ)脾益氣，健脾利水；常采取中藥復(fù)方治療，如四君子湯(sijunzi decoction,SJZD)、六君子湯、理中湯等。為豐富黨參炮制品的臨床應(yīng)用，我們制備了含黨參的四君子湯(SJZD-Ⅰ)、含米黨參的四君子湯(SJZD-Ⅱ)和含蜜黨參的四君子湯(SJZD-Ⅲ)擬用于治療動(dòng)物脾虛證。本研究中，我們探討了SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ對(duì)脾虛證家兔的療效，并探究其對(duì)脾虛證家兔部分血液生理指標(biāo)、料重比和血清中胃腸激素(GAS、MTL)、免疫因子(IL-2、IFN-γ、IL-4)、cAMP/cGMP水平的影響，為黨參炮制品的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物50只健康家兔，體質(zhì)量(1.5±0.3) kg，雌雄各半，由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)藥物黨參(批號(hào)：150401)購自廣州健澤藥業(yè)有限公司，厚樸(批號(hào)：160301)、枳實(shí)(批號(hào)：160901)、麩炒白術(shù)(160701)、茯苓(批號(hào)：160301)購自成都仁濟(jì)宏藥業(yè)有限公司，大黃(批號(hào)：170301)、炙甘草(批號(hào)：170301)購自重慶眾妙藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑兔IL-2、IL-4、IFN-γ、GAS、MTL、cAMP、cGMP等ELISA試劑盒(批號(hào)：201712)均購自廈門惠嘉生物科技有限公司。

1.4 藥物制備

1.4.1厚樸三物湯的制備 參照文獻(xiàn)[10]稱取厚樸、枳實(shí)、大黃三味中藥(3∶3∶2)，加水將厚樸、枳實(shí)浸泡40 min，大黃浸泡20 min；再將厚樸、枳實(shí)煎沸10 min，然后加大黃共煎10 min，過濾；加水再次煎沸10 min，過濾。合并2次濾液，于60℃濃縮至藥液質(zhì)量濃度為0.5 kg/mL，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2黨參炮制品及SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ的制備 取200 g大米至炒藥鍋中，中火加熱至大米冒煙時(shí)，倒入1 000 g切制好的黨參片，炒至大米呈老黃色，篩去米，放冷即得米黨參。取250 g煉蜜加入適量沸水稀釋，加入1 000 g黨參片拌勻并燜透，置炒藥鍋中,文火加熱并炒至棕黃色，不黏手時(shí)取出，放冷即得蜜黨參。SJZD-Ⅰ的制備：稱取黨參、麩炒白術(shù)、茯苓、炙甘草(2∶2∶2∶1)四味藥，加水浸泡30 min,煎煮3次，時(shí)間分別為2.0，1.5，1.0 h，合并3次濾液，濃縮至生藥0.5 kg/mL，即得。同法分別將黨參替換為米黨參和蜜黨參制備得到SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ藥液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分組與處理將家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、SJZD-Ⅰ組、SJZD-Ⅱ組和SJZD-Ⅲ組，每組10只。模型組、SJZD-Ⅰ組、SJZD-Ⅱ組和SJZD-Ⅲ組家兔采用厚樸三物湯(按照5 mL/kg,2 d灌胃)加饑飽失常法(灌胃當(dāng)日禁食，次日飼喂料不限量)建立家兔脾虛證模型，對(duì)照組家兔按照同樣方法灌胃生理鹽水。參照《中獸醫(yī)診斷學(xué)》[11]，家兔表現(xiàn)有精神倦怠、采食量下降或食欲減退、糞便軟或溏、舌色淡白、脈細(xì)弱等主要臨床癥狀，說明家兔脾虛證模型成功建立。家兔脾虛證模型建立后，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組按照2 mL/kg/d分別灌胃SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ藥液，對(duì)照組和模型組按照同樣方法灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃5 d，自由飲食，末次給藥后再觀察2 d。

1.6 脾虛家兔療效觀察與料重比測(cè)定臨床觀察并記錄家兔精神、采食、被毛、口舌及糞便等情況，根據(jù)文獻(xiàn)資料[12]制定脾虛家兔臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1所示)，并參考《中獸醫(yī)學(xué)》[13]和《中獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[14]診療判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效(表2)。在造模成功后和治療結(jié)束時(shí)，對(duì)家兔空腹稱體質(zhì)量并記錄。

表1 家兔脾虛的臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 家兔脾虛療效判定標(biāo)準(zhǔn)

1.7 家兔部分血液生理指標(biāo)、胃腸激素、細(xì)胞因子及cAMP/cGMP水平測(cè)定末次給藥2 d后禁食不禁水8 h，采集家兔耳緣靜脈血抗凝血樣，檢測(cè)RBC和Hb水平；采集凝血血樣置4℃過夜，4 000 r/min離心10 min，吸取血清，嚴(yán)格參照酶聯(lián)免疫(ELISA)法試劑盒說明書，測(cè)定血清中GAS、MTL、IL-2、IL-4、IFN-γ、cAMP和cGMP水平。

1.8 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析和Duncan多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛證家兔的臨床治療效果觀察對(duì)照組家兔活動(dòng)敏捷、皮毛光亮、飲食欲俱佳、糞便正常。模型組家兔出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，精神倦怠，飲食欲低下，體瘦毛焦，肚腹脹滿，糞便稀軟，舌苔嫩白，脈細(xì)弱等癥狀。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔精神狀況和飲食欲恢復(fù)正常，被毛、口舌、脈象及糞便形態(tài)基本恢復(fù)正常。各治療組脾虛家兔的治療結(jié)果詳見表3。

表3 各治療組脾虛證家兔療效

2.2 不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛證家兔料重比及血液生理指標(biāo)的影響如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組家兔體質(zhì)量下降，其平均日增重和料重比為負(fù)值，差異極顯著(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔平均日增重增加，料重比為正值，差異極顯著(P<0.01)。如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組家兔血液中RBC和Hb含量均有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血液中RBC和Hb含量有升高的趨勢(shì)，其中SJZD-Ⅲ組家兔血液中Hb含量顯著升高(P<0.05)。

圖1 家兔部分血液生理指標(biāo)變化

表4 家兔料重比變化

2.3 不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛證家兔胃腸激素的影響與對(duì)照組比較，模型組家兔血清中GAS水平降低，差異不顯著(P>0.05)；MTL水平降低，差異極顯著(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中GAS水平均升高，差異顯著(P<0.05)；SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中MTL水平均升高，差異極顯著(P<0.01)，見圖2。

圖2 家兔血清中GAS、MTL水平變化

2.4 不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛證家兔血清IL-2、IL-4、IFN-γ的影響與對(duì)照組比較，模型組家兔血清中IL-2、IFN-γ水平極顯著降低(P<0.01)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清IL-2、IFN-γ水平均極顯著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中IL-4水平有降低的趨勢(shì)，其中SJZD-Ⅱ組家兔血清中IL-4水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 家兔血清中IL-2、IL-4，IFN-γ水平變化

2.5 不同黨參炮制四君子湯對(duì)脾虛證家兔血清cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP的影響與對(duì)照組比較，模型組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均極顯著降低(P<0.01)，cGMP水平極顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均極顯著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中cGMP水平均有降低的趨勢(shì)，SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ組家兔血清中cGMP水平分別極顯著和顯著降低(P<0.01和P<0.05)，見圖4。

圖4 家兔血清中cAMP、cGMP水平及其比值變化

3 討論

研究表明，四君子湯能通過改善腸道菌群的多樣性調(diào)理脾虛證[15]。經(jīng)典四君子湯和獸用四君子湯的君藥分別為人參和黨參，而人參和黨參都?xì)w脾、肺二經(jīng)，能補(bǔ)脾益氣，提高機(jī)體免疫力。中藥炮制的目的主要是加強(qiáng)藥物功效，減輕毒性或副作用。蜜炙的方法多用于炮制止咳平喘，補(bǔ)脾益氣的藥材；米炒的炮制方法能緩和黨參燥性，用于治療脾胃虛弱等證候[16]。本研究表明，含黨參、米黨參和蜜黨參的四君子湯對(duì)家兔脾虛證的治愈率分別達(dá)到了80%，80%，90%，說明不同黨參炮制四君子湯均對(duì)動(dòng)物脾虛證有較好的療效，其中以含蜜黨參的四君子湯效果最佳，推測(cè)黨參經(jīng)過蜜炙后其補(bǔ)中益氣作用得以增強(qiáng)。

中醫(yī)“脾”的功能主要以消化為主，消化系統(tǒng)功能的異常是脾虛證最基本的病理變化。在消化過程中，GAS能刺激消化液分泌，促進(jìn)胃竇收縮；MTL則刺激胃蛋白酶分泌，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。研究表明，脾虛證動(dòng)物血清中GAS、MTL水平明顯低于正常動(dòng)物[17]；高云芳等[18]研究結(jié)果提示，四君子湯可能通過促進(jìn)胃液分泌而提高胃泌素的分泌水平。本研究結(jié)果表明，脾虛證家兔血清中GAS、MTL水平降低，體質(zhì)量減少；而不同黨參炮制四君子湯均能提高脾虛證家兔血清中GAS、MTL水平，促進(jìn)體質(zhì)量增加，說明不同黨參炮制四君子湯均能增強(qiáng)脾虛證動(dòng)物胃腸道消化功能。本研究結(jié)果提示，四君子湯中米黨參和蜜黨參相比黨參組方更能促進(jìn)胃腸消化吸收。

中醫(yī)古籍記載“中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血”，當(dāng)中焦脾胃虛弱時(shí)，則不能運(yùn)化水谷精微，血液化源不足，導(dǎo)致出現(xiàn)如貧血、口色淡白等血虛之癥。機(jī)體血液中RBC、Hb水平可作為評(píng)價(jià)脾虛證的穩(wěn)定性指標(biāo)[19]。本研究表明，脾虛證家兔血液中RBC和Hb水平有降低的趨勢(shì)，與曹立亭等[20]研究報(bào)道結(jié)果基本一致；而不同黨參炮制四君子湯均能提高血液中RBC和Hb水平。血液中RBC的增加是貧血恢復(fù)的指征，說明不同黨參炮制四君子湯均發(fā)揮了補(bǔ)脾益氣的效果。血紅蛋白水平的增高是機(jī)體免疫力提高的表現(xiàn)[21]，提示不同黨參炮制四君子湯均能增強(qiáng)脾虛動(dòng)物的免疫功能。

“四季脾旺不受邪”的論述亦表明脾虛證動(dòng)物的免疫功能低下[22]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，脾臟的免疫功能與體液免疫和細(xì)胞免疫有一定相關(guān)性，且還與多種細(xì)胞因子相關(guān)[23]。IL-2、IFN-γ和IL-4等免疫因子可由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，參與機(jī)體廣泛的免疫調(diào)節(jié)。IL-2能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性；IFN-γ能上調(diào)MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)抗原呈遞能力；IL-4能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖以及產(chǎn)生抗體[24]。研究認(rèn)為，脾虛證動(dòng)物免疫功能低下主要是以細(xì)胞免疫因子的活性降低和紊亂為主[4]。本研究表明，脾虛證家兔血清中IL-2、IFN-γ水平顯著降低，IL-4水平顯著升高，說明脾虛證家兔免疫功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致IL-2、IFN-γ、IL-4水平異常變化，與文獻(xiàn)[25]結(jié)果一致。不同黨參炮制四君子湯均能提高家兔血清中IL-2、IFN-γ水平，降低IL-4水平，推測(cè)不同黨參炮制四君子湯可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性，增強(qiáng)脾虛證動(dòng)物免疫功能。

環(huán)磷酸腺苷蛋白激酶(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)信號(hào)傳導(dǎo)通路是物質(zhì)能量代謝的主要細(xì)胞傳導(dǎo)通路，該通路的激活為細(xì)胞代謝輸送能量。研究表明，cAMP-PKA通路在脾虛證的過程中被激活[26]。有學(xué)者認(rèn)為cAMP/cGMP在細(xì)胞代謝及免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，cAMP/cGMP的比值升高利于機(jī)體免疫功能增強(qiáng)；且兩者具有明顯的拮抗性，與陰陽對(duì)立、消長(zhǎng)十分相似[27]。魏彥明等[6]認(rèn)為，cAMP/cGMP具有免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)cAMP升高而cGMP降低時(shí)，巨噬細(xì)胞的功能最強(qiáng)；cAMP還能增強(qiáng)干擾素的活性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，脾虛證家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值顯著降低，而cGMP的水平顯著升高，與文獻(xiàn)[28]結(jié)果一致。推測(cè)脾虛動(dòng)物因cAMP、cGMP分泌紊亂，導(dǎo)致了水谷運(yùn)化不暢，細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化受阻，免疫功能降低。經(jīng)不同黨參炮制四君子湯治療后，脾虛家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值均顯著升高，cGMP的水平降低，cAMP、cGMP水平趨于平衡，說明不同黨參炮制四君子湯均能通過調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路來增強(qiáng)免疫，達(dá)到陰平陽秘的作用。