永生化犬骨髓間充質干細胞株的建立

陳奕靜，戴鵬秀，張露文，李佳鍇，張翊華

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊陵 712100)

近年來，越來越多的家庭開始重視寵物的健康，雖然現代寵物醫療有了很大的提高，但仍有許多嚴重的疾病不能通過臨床治療手段解決。干細胞療法是臨床實踐中的創新,間充質干細胞(MSCs)位于受損部位，分化為組織特有的細胞，并有助于組織修復[1]。利用骨髓間充質干細胞(BMSCs)進行臨床疾病治療是具有廣闊前景的研究領域[2]。與其他干細胞的不同之處在于，它們不僅可分化為相同的中胚層譜系，如骨骼、軟骨和脂肪細胞，而且還可分化為其他外胚層和內胚層譜系[3]，因此，BMSCs是成體干細胞的獨特類型。

BMSCs具有多向分化潛能、免疫原性及歸巢能力，并且取材較為方便，動物骨髓可再生，因此是組織工程種子細胞的首要選擇[4]。但BMSCs在骨髓中含量非常有限，體外培養周期短，如果不能盡快使用成功分離的BMSCs，待其傳過多代后，各項性能將會明顯下降，無法進行下一步研究和應用[5]。建立永生化細胞株可以使體外培養的細胞無限繁殖并且細胞間不存在差異。自發性永生化幾率十分小，可利用基因轉染等技術提高永生化的發生率，以此來建立永生化細胞株。因此，本試驗將構建好的pLOX-Ttag-iresTK慢病毒載體包裝后感染犬cBMSCs，連續培養傳至50代，并通過細胞形態觀察、細胞計數、RT-qPCR基因表達分析、Western blot以及流式和三系分化鑒定，建立永生化犬骨髓間充質干細胞(cBMSCs)，為臨床疾病治療研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和試驗材料質粒pLOX-Ttag-iresTK、pLP/PsPAX、pLP/VSVG(Addgene公司)；Stbl3感受態細胞(北京華越洋生物科技有限公司)；293T細胞和cBMSCs由西北農林科技大學動物醫學院外科實驗室保存[6]；無內毒素質粒提取試劑盒、2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(杭州博日科技有限公司)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，Japan)；BOSTER Western blot檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)；Asvanced Transfection Reagent、胎牛血清(FBS)(ZETA LIFE，USA)、α-MEM培養基、DMEM培養基(Hyclone，USA)；犬骨髓間充質干細胞成脂誘導分化完全培養液、成骨誘導培養液、軟骨誘導完全培養液(賽業生物科技有限公司)。

1.2 cBMSCs的復蘇與培養傳代使用α-MEM培養基復蘇實驗室凍存的第3代cBMSCs，于37℃、5% CO2培養箱中進行培養。待其長至80%～90%融合時，用胰酶消化，待90%的細胞變圓時吸出胰酶，加入2 mL α-MEM完全培養基(含10% FBS)，吹打細胞后按1∶2傳代，十字形晃動培養皿使細胞均勻分布，平均3 d傳1代。

1.3 包裝攜帶SV40基因的慢病毒分別將包裝質粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和質粒pLOX-Ttag-iresTK轉化至Stbl3感受態細胞中，將菌液涂布在LB培養基(含100 mg/L 卡那霉素)上，37℃培養箱中倒置平板過夜培養。待質粒擴增后，用天根試劑盒提取質粒。以1×106個/mL的密度將293T細胞接種至60 mm培養皿中，加入含10% FBS的DMEM培養液，37℃、5% CO2條件下培養24 h。待細胞融合至60%左右時，將包裝質粒pLP/PsPAX 2.8 μg、pLP/VSVG 2.0 μg和質粒pLOX-Ttag-iresTK 1.8 μg與10.0 μL轉染試劑Asvanced Transfection Reagent混合，混勻后靜置10 min，逐滴將轉染復合物加至培養皿中。24 h后，換入新鮮培養基，繼續培養48 h后，收集細胞上清并進行滴度測定。

1.4 永生化cBMSCs株的構建cBMSCs融合度達到60%時，將收集的慢病毒上清液和α-MEM培養液按照1∶1的體積比例換至cBMSCs進行轉染；8 h 后吸出液體加入3 mL α-MEM培養液，48 h使用4 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，將穩定轉染的cBMSCs傳代，用α-MEM(含10% FBS)進行培養，37℃、5%CO2條件下，連續傳超過50代后，即可得到永生化的cBMSCs株。

1.5 永生化cBMSCs株的鑒定

1.5.1細胞生長曲線和群體倍增時間的測定 在相差顯微鏡下觀察永生化cBMSCs的形態變化，并與未經轉染的cBMSCs進行比較。取第50代永生化cBMSCs和未經轉染的野生cBMSCs，以0.5×104個/孔的細胞密度接種于24孔培養板，每天取3孔進行細胞計數，取所得到的平均值記作當天的細胞數，連續計數7 d，繪制其生長曲線。cBMSCs的群體倍增時間(PDT)根據公式PDT=T×[lg2/(lgNt-lgN0)]估算。N0為接種細胞數，Nt為培養后的細胞數，T為培養時間，以h為單位。

1.5.2野生型和永生化第50代cBMSCs SV40的表達檢測 人工設計并合成1對片段大小為386 bp的特異性檢測引物(F：5′-TGACCTCCATAGAA-GACACCG-3′；R：5′-CAAATACCTCAGTTGCA-TCCC-3′)。按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書對第50代永生化cBMSCs和未經轉染的野生cBMSCs進行總RNA的提取，將mRNA反轉錄為cDNA。按照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix說明書配置反應體系進行基因表達檢測。每個樣本基因檢測3個復孔，數據采用2-△△Ct法進行分析。用細胞裂解法提取野生型和永生化第50代的cBMSCs細胞內總蛋白，BCA法鑒定蛋白濃度。按照BOSTER Western blot檢測試劑盒說明書對SV40T進行Western blot檢測，內參蛋白為GAPDH。

1.5.3永生化cBMSCs的分化潛能及表面標志鑒定 將第50代永生化cBMSCs按1×104個/cm2密度接種于24孔培養板中，待融合至80%左右用成脂、成骨、成軟骨分化試劑盒進行誘導分化。誘導完成后分別使用油紅O染色液、茜素紅染液和阿利辛藍染液對細胞進行染色，顯微鏡下觀察染色結果。將第50代永生化cBMSCs重懸，計算調整細胞密度，制成2×106個/mL的細胞懸液，取流式細胞儀專用管11個，分別加入100 μL細胞懸液，隨后分別加入FITC標記的CD105、CD14、CD166、CD29、CD44、CD45，PE標記的CD90、CD11、CD34抗體以及對照抗體各5 μL，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞表面分子標記物。

2 結果

2.1 細胞形態觀察相差顯微鏡觀察發現，cBMSCs呈長梭狀，少數為多角形，貼壁生長。野生型在第10代時細胞形態明顯發生變化，生長緩慢，同期永生化細胞狀態良好，生長速度較快。永生化在第50代時細胞活力仍較高，與原代細胞形態無明顯差異，呈旋渦狀排列(圖1)。

A.野生型第10代；B.永生化第10代；C.永生化第50代

2.2 細胞生長曲線測定對永生化第50代及野生型cBMSCs進行細胞計數并繪制生長曲線，結果如圖2所示。2種細胞在培養過程中，均持續增殖呈“S”型狀態，且成功轉染SV40的永生化cBMSCs相對于野生型細胞潛伏期縮短，增殖較快且數量較多。永生化cBMSCs的群體倍增時間約為0.68 d，野生型cBMSCs的群體倍增時間約為0.97 d。

圖2 永生化cBMSCs第50代與野生型cBMSCs的生長曲線

2.3 野生型和永生化第50代cBMSCs SV40的RT-qPCR檢測和蛋白鑒定由圖3可見，永生化cBMSCs中SV40的mRNA表達水平較野生型極顯著升高(P<0.001)。使用GAPDH作為蛋白質標準化內參，對已經轉染SV40的cBMSCs進行蛋白質免疫印跡測定，結果顯示永生化cBMSCs成功表達SV40T抗原。

圖3 永生化與野生型cBMSCs SV40 RT-qPCR(A)和Western blot結果(B)

2.4 永生化cBMSCs流式細胞術檢測流式檢測結果如圖4所示，細胞表面分子CD105(97.0%)、CD90(93.4%)、CD166(98.8%)、CD29(92.2%)和CD44(93.6%)為陽性表達，而CD11(1.4%)、CD14(0.4%)、CD34(1.0%)和CD45(1.2%)為陰性表達。

A.空白對照組；B.陰性表面分子；C.陽性表面分子

2.5 永生化cBMSCs三系分化永生化cBMSCs經成骨誘導后，可發現細胞形態發生變化，細胞變長或呈多邊形伸展，茜素紅染色可見橘紅色鈣化結節；經成軟骨誘導后，細胞體積變大呈多邊形，阿爾新藍將軟骨相關蛋白染成藍色；經成脂肪細胞誘導培養7 d后，細胞變短，細胞質內出現脂滴，油紅O染液將胞內脂滴染成紅色(圖5)。

A.cBMSCs成骨誘導后茜素紅染色；B.cBMSCs成軟骨誘導后阿爾新藍染色；C.cBMSCs成脂肪誘導后油紅O染色

3 討論

BMSCs可從成體骨髓獲取并非必須來自胚胎，因其來源廣泛，易于獲取，并且不涉及道德倫理問題,相較于其他干細胞有明顯優勢。因其免疫調節能力的獨特性，有助于抑制移植后的排斥反應，所以BMSCs被認為是組織工程和再生醫學的理想候選者。BMSCs在骨髓中含量非常有限，體外培養周期短，常因復制衰老而死亡限制了它們的試驗和臨床研究[7]。因此，永生化BMSCs的建立對于這些細胞的應用十分有利。

除了自發性永生化，常用病毒轉染、端粒酶活化和癌基因轉染等方法促使永生化[8]。人乳頭瘤病毒和EB病毒易誘發細胞惡性轉化，原癌細胞永生化操作困難，因此最常用的永生化基因是SV40和端粒酶逆轉錄酶。SV40T抗原影響細胞周期檢查點，防止細胞凋亡衰老，并促使細胞增殖[9]。單獨轉染SV40不足以誘導哺乳動物細胞腫瘤的發生[10]。

程斌等[11]將含有SV40基因的真核表達載體導入BMSCs中，發現試驗組細胞的生長速率明顯高于對照組，且未發現成瘤性。AYALA-CUELLAR等[12]用SV40逆轉錄病毒轉染ASCs使其永生化，與原始ASCs相比具有更高的集落形成潛能，并且群體倍增時間減少。ZHANG等[13]將SV40導入前軟骨細胞后，發現細胞隨著培養時間的延長，數量增加但端粒酶長度未明顯縮短，證明SV40能夠避免細胞凋亡。

我們成功通過轉染SV40構建了cBMSCs永生化細胞株。通過細胞形態和生長曲線的觀察，野生型cBMSCs在傳代培養至第10代后有衰老死亡的跡象，細胞倍增時間明顯延長，增殖速度顯著下降，胞體形狀也出現變化，多角及不規則形比例變大。與野生型cBMSCs相比，永生化的cBMSCs具有更高的生長速率，保持“長梭狀”的細胞形態，并形成單克隆細胞群，傳至50代后細胞仍然生長良好，同他人培養傳代的細胞形態和生長曲線走向相似[14-15]，證明了永生化cBMSCs具有更好的增殖能力。RT-qPCR和Western blot結果表明本次試驗確定已將SV40轉入cBMSCs并成功表達。

目前，BMSCs的特異性表面標記物還未確定，但根據以往長期研究發現，相對穩定的BMSCs高表達表面抗原標記包括CD105、CD29、CD44、CD106、CD166、CD90等，基本上不表達HLA-Ⅱ類抗原以及其刺激分子，如CD40、CD80、CD86、CD45、CD14、CD34、CD38，亦不表達CD11a、LFA-1等淋巴細胞表面抗原和造血干細胞標記分子[16]。CD44是參與細胞遷移和血管生成的透明質受體[17-18]，而且它似乎與CD90在維持干性狀態方面也有功能上的關聯。CD45是一種跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在T細胞和B細胞中作為抗原受體信號的關鍵調節因子，其在造血譜系的所有發育階段高表達[12]。本試驗對永生化第50代cBMSCs表面標志物進行分析，結果顯示，細胞表達CD105、CD90、CD166、CD29、CD44，幾乎不表達 CD11、CD14、CD34、CD45，與文獻報道一致，表明構建的永生化細胞符合BMSCs的生物學特性。

據報道，BMSCs具有自我更新及多向分化能力，可在特定的體內外微環境下，分化為不同的組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、髓基質、神經元細胞、脂肪細胞、胰腺細胞、星形膠質細胞、血管內皮細胞、心肌細胞等[19]。與ASCs相比，其具有更高的成骨成軟骨分化能力[20]。我們測試了永生化cBMSCs在分化成骨、成軟骨、成脂肪方面的多能性，最終在各染色鏡檢所得圖像中發現各分化方向的特異性染色標志，說明本次所得永生化cBMSCs細胞株是具有多向分化能力的細胞株。同其他相似試驗所得誘導分化染色圖像對比，染色標志的呈現大同小異[21]，進一步確定得到的永生化cBMSCs具有分化潛能。

本研究通過轉染SV40建立穩定的永生化細胞株，具有與原代細胞相似的特性，達到了使體外培養的BMSCs具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的，并且可以成為進一步研究細胞信號并了解其性質的有效模型，幫助我們了解骨髓間充質干細胞增殖與衰老的分子機制，為研究疾病治療如控制腫瘤細胞增殖及器官移植等奠定基礎。