高羊毛氨酸硒對幼齡比格犬抗氧化指標(biāo)及狂犬病疫苗免疫效果的影響

鄭謀鳳，余紫薇，馬田寧，祝徐航，姜 勝，宋泉江，周 彬，李 鼎，顧 垚，王曉杜，宋厚輝*，邵春艷*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3.動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；4.浙江農(nóng)林大學(xué) 集賢學(xué)院，浙江 杭州 311300；5.英聯(lián)貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200051)

硒(selenium,Se)是人類和動物生命活動所必需的一種微量元素[1-3]。硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的重要組成成分，其參與清除機(jī)體新陳代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而維持了生物膜的完整性[4-7]。此外，研究顯示硒能廣泛提高機(jī)體免疫功能，如提高免疫系統(tǒng)細(xì)胞增殖，抗體合成和免疫細(xì)胞吞噬能力等[8-10]。膳食硒補(bǔ)充劑主要有2種形式：無機(jī)硒和有機(jī)硒，其中有機(jī)硒具有易吸收、毒性低和副作用小等特點(diǎn)而被廣泛使用。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine,SeHLan)是一種新型有機(jī)硒，使用產(chǎn)朊假絲酵母為菌株發(fā)酵亞硒酸鈉，其生物利用度高于蛋氨酸硒[11-12]，目前已在家畜和家禽飼養(yǎng)中開始推廣應(yīng)用[13]。近年來，寵物營養(yǎng)和保健受到越來越多關(guān)注，但目前，在犬上，還未見有SeHLan相關(guān)的研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過給幼犬接種狂犬病疫苗的同時(shí)，在基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的SeHLan，檢測各組犬的抗氧化指標(biāo)和狂犬病抗體IgG滴度，以期為SeHLan的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物3月齡雄性比格犬25只(狂犬病抗原檢測均為陰性)，體質(zhì)量為(5.65 ± 0.13) kg，基礎(chǔ)體檢正常，已接種常規(guī)傳染病疫苗，定期體內(nèi)外驅(qū)蟲，購于常州貝樂實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司(實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0007)。

1.2 主要試劑SeHLan(商品名：英特硒)由英國聯(lián)合農(nóng)業(yè)集團(tuán)提供；犬貓狂犬病抗體檢測試劑盒(批號：YJ096)購自法國辛百克斯公司；犬狂犬病疫苗購自碩騰動物保健品公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)比格犬隨機(jī)分為5組，每組5只，分別為空白組(Ⅰ組)、疫苗組(Ⅱ組)和SeHLan添加組(Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組)。Ⅰ組僅飼喂基礎(chǔ)日糧，Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)日糧并接種狂犬病疫苗；SeHLan添加組接種狂犬病疫苗的同時(shí)，在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加不同劑量的SeHLan，添加劑量分別為Ⅲ組0.35 mg/kg、Ⅳ組1.00 mg/kg、Ⅴ組2.00 mg/kg按干物質(zhì)添加(以硒計(jì))。

1.4 試驗(yàn)日糧與飼養(yǎng)管理按照歐洲寵物食品工業(yè)聯(lián)合會(FEDIAF)頒布的《貓和狗寵物食品的營養(yǎng)指南》中犬健康成長營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范給予基礎(chǔ)日糧，保證每只比格犬每天攝入的能量不低于397.5 kJ/kg[14-15]。基礎(chǔ)日糧送檢浙江省國正檢測技術(shù)有限公司。基礎(chǔ)日糧配方和營養(yǎng)成分見表1。SeHLan按照劑量與日糧徹底混合后再飼喂給比格犬，每日早、中、晚各飼喂1次，自由飲水，試驗(yàn)期間室內(nèi)溫度維持在20～ 25℃。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.5 樣品采集疫苗組和SeHLan添加組犬接種狂犬病疫苗，空白組犬注射同等體積的生理鹽水。接種狂犬病疫苗當(dāng)天記為0 d，SeHLan添加組比格犬日糧中開始添加SeHLan。分別在免疫后0，3，7，14，21，28,35 d從犬的前肢頭靜脈采血，分離血清-20℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)中犬血清硒、抗氧化指標(biāo)(GSH-Px、SOD和MDA)和狂犬病抗體IgG滴度的測定。

1.6 樣品測定犬血清抗氧化指標(biāo)(GSH-Px、SOD和MDA)的檢測方法根據(jù)各檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作；血清硒含量依據(jù)WS/T 109—1999標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定(浙江省國正檢測技術(shù)有限公司)；狂犬病抗體IgG滴度根據(jù)SerelisaTM狂犬病抗體檢測試劑盒(SYNBIOTICS)操作說明進(jìn)行測定，判定標(biāo)準(zhǔn)：若抗體滴度≥0.6 IU/mL，說明該抗體水平對狂犬病病毒具有保護(hù)力，若抗體滴度<0.6 IU/mL，說明該抗體水平對狂犬病病毒不具有保護(hù)力。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量SeHLan對比格犬血清硒含量的影響由圖1可知，空白組和疫苗組比格犬血清硒含量在試驗(yàn)周期呈上升趨勢，且呈顯著性差異(P<0.05)，但升高幅度較小。SeHLan添加組犬血清硒含量在免疫后3 d后開始升高，與空白組相比差異顯著(P<0.05)，且隨著SeHLan添加劑量的增加，血清硒含量也逐漸升高。

注：有相同大寫或小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；字母相同而大小寫不同表示差異顯著(P<0.05)；無相同字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 不同劑量SeHLan對比格犬血清抗氧化指標(biāo)的影響由表2可知，空白組和疫苗組犬血清GSH-Px活性在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)保持穩(wěn)定，SeHLan添加組犬在飼喂SeHLan 1周后，血清GSH-Px活性即開始顯著增強(qiáng)，且隨SeHLan添加量的增加而增強(qiáng)，差異極顯著(P<0.01)，在飼喂SeHLan 1個(gè)月后，SeHLan添加組犬血清GSH-Px活性可以達(dá)到空白組的2倍。

表2 不同劑量SeHLan對比格犬血清中GSH-Px活性的影響 U/mL

由表3可知，在試驗(yàn)周期內(nèi)，空白組犬血清SOD活性基本保持穩(wěn)定。疫苗組犬血清SOD活性在試驗(yàn)開始后逐漸上升，在免疫后14 d左右達(dá)到高峰，之后逐漸下降至與空白組犬血清SOD活性相當(dāng)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，SeHLan添加組犬血清SOD活性均高于空白組，且差異極顯著(P<0.01)，在免疫后21 d左右到達(dá)高峰，之后開始逐漸下降并穩(wěn)定。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，SeHLan添加組犬血清SOD含量仍顯著高于空白組和疫苗組(P<0.05)。

表3 不同劑量SeHLan對比格犬血清中SOD活性的影響 U/mL

由表4可知，空白組犬血清MDA含量在試驗(yàn)開始7 d內(nèi)保持穩(wěn)定，之后開始緩慢下降，從免疫后21 d開始急劇下降。疫苗組犬血清MDA含量在整個(gè)試驗(yàn)期間也呈逐漸下降趨勢，并在免疫后14 d開始與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。SeHLan添加組犬血清MDA含量在免疫后3 d即開始降低，差異極顯著(P<0.01)，在整個(gè)試驗(yàn)期間其下降幅度均高于同期空白組和疫苗組，差異極顯著(P<0.01)。其中SeHLan添加組(1.00 mg/kg)下降幅度最大，其他2個(gè)劑量組(0.35，2.00 mg/kg)之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同劑量SeHLan對比格犬血清中MDA含量的影響 μmoL/L

2.3 不同劑量SeHLan對比格犬狂犬病抗體IgG滴度的影響由圖2可知，空白組比格犬狂犬病抗體IgG滴度在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)均維持在基礎(chǔ)水平，疫苗組和SeHLan添加組比格犬狂犬病抗體IgG滴度于免疫后3 d開始上升，在免疫后14 d達(dá)到峰值并維持2周左右后緩慢下降。其中，SeHLan添加組(1.00 mg/kg)狂犬病IgG抗體滴度從免疫后7 d開始均顯著高于同期疫苗組(P<0.05)，且免疫后7 d抗體滴度已與疫苗組免疫后14 d相當(dāng)，說明日糧中添加SeHLan(1.00 mg/kg)可以顯著增強(qiáng)狂犬病疫苗免疫效果。

圖2 不同劑量SeHLan對比格犬狂犬病抗體IgG滴度的影響

3 討論

動物血清硒含量取決于食物中硒的含量，研究顯示，犬血清硒濃度對食物中硒含量變化的反應(yīng)最為敏感，可作為犬體內(nèi)硒含量的一種生物標(biāo)志物[14,16]。在本研究中，空白組和疫苗組比格犬僅飼喂基礎(chǔ)日糧，隨著比格犬日齡增長，體質(zhì)量不斷增加，每日攝取的基礎(chǔ)日糧也在增加，基礎(chǔ)日糧中硒含量為0.06 mg/kg，所以這2組比格犬血清硒含量也呈逐漸上升趨勢，但其上升幅度平緩。SeHLan添加組在基礎(chǔ)日糧中添加SeHLan后1周內(nèi)，血清硒含量即開始升高，且犬血清硒含量與添加的SeHLan呈劑量依賴關(guān)系。研究顯示，日糧中添加硒可提高馬血漿硒水平，且有機(jī)硒比無機(jī)硒的效果更為明顯[17-18]。

GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)的重要成員，反映了機(jī)體抗氧化能力。硒是GSH-Px的活性中心，硒的狀態(tài)直接影響此酶的活性。本研究表明在比格犬日糧中添加一定量的SeHLan可顯著增強(qiáng)犬血清GSH-Px活性，且血清GSH-Px活性隨SeHLan添加量的增加而增強(qiáng)，差異極顯著(P<0.01)。這一變化與血清硒含量變化一致，表明犬血清硒濃度和GSH-Px活性與SeHLan添加劑量均呈現(xiàn)劑量依賴性。

SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。在試驗(yàn)周期內(nèi)，與空白組和免疫組相比，各SeHLan添加組犬血清SOD活性上升趨勢更為明顯。其中，SeHLan(0.35，2.00 mg/kg)添加組幼齡比格犬血清SOD活性在免疫后14 d開始呈下降趨勢，而SeHLan(1.00 mg/kg)組犬血清SOD活性在免疫后21 d出現(xiàn)下降，說明日糧中1.00 mg/kg的SeHLan添加量可延長犬血清SOD活性的上升期。

生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，因而MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度。本研究中，空白組和疫苗組犬血清MDA含量呈逐漸下降趨勢，這可能與幼犬日齡增加，機(jī)體抵抗力不斷增強(qiáng)有關(guān)。本試驗(yàn)周期內(nèi)SeHLan添加組的犬血清MDA含量也有不同程度的降低，下降幅度均高于同期空白組和疫苗組。其中，日糧中1.00 mg/kg的SeHLan添加量對降低犬血清MDA含量影響更為有效。

硒缺乏可影響人類和家畜的先天性免疫和獲得性免疫，如嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能，淋巴細(xì)胞功能和抗體產(chǎn)生等[19-21]。研究顯示，補(bǔ)充硒可提高成年馬和馬駒的體液免疫功能[22-23]。抗體IgG滴度的高低可反映犬的特異性免疫狀態(tài)，在本試驗(yàn)中，在接種狂犬病疫苗的同時(shí)，日糧中添加SeHLan(1.00 mg/kg)組幼齡比格犬狂犬病抗體IgG滴度上升又高又快，與疫苗組差異顯著(P<0.05)，但SeHLan添加組(0.35和2.00 mg/kg)幼齡比格犬狂犬病抗體IgG滴度與疫苗組相比，無顯著性差異(P>0.05)，說明SeHLan可顯著提高幼齡比格犬狂犬病抗體IgG滴度，但其效果與硒的添加劑量相關(guān)。REIS等[24]的相關(guān)研究顯示，日糧中添加3.6 mg 亞硒酸鈉可促進(jìn)牛狂犬病中和抗體產(chǎn)生的持久性，但補(bǔ)充過量的硒可能導(dǎo)致免疫抑制，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

張晉輝[25]通過研究不同硒源對豬肌肉硒沉積的影響，發(fā)現(xiàn)SeHLan比酵母硒(SeMet)和亞硒酸鈉(SS)能更有效地整合到肌肉中，并且Se的肌肉沉積量會隨著SeHLan的添加量增加而升高。這種劑量依賴性在有關(guān)富硒畜禽產(chǎn)品的研究中也有體現(xiàn)，在肉雞試驗(yàn)中，0.40 mg/kg的SeHLan處理組肌肉硒含量比0.10 mg/kg處理組高出90%左右；在蛋雞試驗(yàn)中，0.60 mg/kg SeHLan處理組雞蛋中硒含量比0.30 mg/kg處理組至少高出20%[12]。研究證明，機(jī)體內(nèi)硒的生物效應(yīng)、氧自由基的含量與硒濃度三者之間的關(guān)系呈倒置Weinberg曲線型，即硒在低濃度范圍內(nèi)可以清除氧自由基，且清除效果隨著硒濃度增大而增強(qiáng)[26]。當(dāng)硒處于高濃度范圍內(nèi)時(shí)，硒催化產(chǎn)生ROS，且隨硒濃度增大，ROS產(chǎn)生量增多，此時(shí)硒的生物效應(yīng)表現(xiàn)為毒性效應(yīng)。綜合本試驗(yàn)可以看出，日糧中添加SeHLan對幼齡比格犬抗氧化指標(biāo)和狂犬病疫苗免疫效果的影響與該硒的補(bǔ)充劑量密切相關(guān)，其中，犬血清SOD活力、犬血清MDA含量、狂犬病抗體IgG滴度三者與SeHLan添加劑量之間為非劑量依賴性，而犬血清硒濃度和GSH-Px活性與SeHLan添加劑量均呈現(xiàn)劑量依賴性。在呈現(xiàn)劑量依賴性情況下，2.00，1.00 mg/kg這2個(gè)SeHLan的添加量之間差異并不顯著，但在生產(chǎn)過程中考慮到成本問題，1.00 mg/kg的SeHLan添加量最為合適。

本研究表明日糧中添加SeHLan可提高幼齡比格犬的抗氧化能力，具體表現(xiàn)為可顯著提高血清中GSH-Px和SOD活性，顯著降低血清中MDA含量。SeHLan可顯著提高幼齡比格犬狂犬病抗體IgG滴度，且在添加劑量為1.00 mg/kg時(shí)作用最顯著。綜上所述，幼犬在日糧中添加1.00 mg/kg的SeHLan，可有助于提高犬的抗氧化能力與狂犬病疫苗免疫效果。