中藥復合小肽對于肉雞小腸形態、盲腸腸道菌群和生產性能的影響

崔宇擎，盧春雨，劉依山，靳國忠，郭藝偉，史萬玉,2*，包永占,2*，張曉東

( 1.河北農業大學 中獸醫學院,河北 保定 071000;2.河北省中獸藥工程技術研究中心,河北 保定 071000；3.河北肽豐生物科技有限公司，河北 邯鄲 056000)

過去10年里，人們對功能性食品的興趣不斷增長，詳細介紹食品衍生的生物活性肽有益作用的知識也越來越多[1]。從植物和動物蛋白中都發現了生物活性肽，據研究表明，生物活性肽具有廣泛的藥理活性作用，如抗菌活性、促進礦物質吸收、降血壓降血脂、免疫調節作用以及腸道調節作用等[2]。已有研究報道，攝入大豆肽比攝入蛋白質或氨基酸混合物更容易被機體吸收，并能促進雞嗉囊、空腸、盲腸與直腸內乳酸菌的增殖，抑制大腸桿菌和需氧菌增殖[3]。另有研究發現，飼料中添加適度比例黃芪，可通過影響乳酸菌和大腸桿菌的豐度，提高斷乳仔豬生長性能[4]。劉衛東等[5]試驗表明，在肉雞日糧中適當添加復合小肽制劑，有利于雛雞免疫器官的發育，降低死亡率和發病率。李巨民等[6]試驗表明，在日糧中添加中藥復合小肽能提高飼料消化利用率，防治高血脂癥和炎癥的發生。

腸道微生物群是其宿主不可分割的組成部分。微生物群在宿主的健康上起著關鍵作用，包括腸上皮細胞的增殖、對病原體的防御、次生代謝產物的產生和復雜碳水化合物的消化。這個微生態系統可以執行許多代謝功能，這些功能會隨著腸道內微生物組成的變化而變化[7]。腸道微生物是人類和動物健康的重要指標。本研究探討了在肉雞飼料中添加不同劑量中藥復合小肽對肉雞腸道發育的影響。通過高通量測序分析探究中藥復合小肽對肉雞腸道菌群的影響，進而促進中藥復合小肽在肉雞健康養殖中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料中藥復合小肽成分為大豆肽64.8%、小麥胚芽粉25.0%、黃芪酶解物10.0%、維生素C 0.2%，由河北肽豐生物科技有限公司提供；酶制劑為50 000 U/g木聚糖酶，由河北肽豐生物科技有限公司提供；微生態制劑為枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌，由河北肽豐生物科技有限公司提供。

1.2 試驗動物及分組選用1日齡健康AA肉仔雞60只，由河北大午有限公司提供。隨機分為6組，每組10只。MC組為空白對照組，飼喂基礎日糧；MD、MZ、MG組，分別在基礎日糧中添加低(250 g/t)、中(500 g/t)、高(750 g/t)劑量的中藥復合小肽；MS組為微生態制劑組(100 g/t微生態制劑)；MM組為酶制劑組(100 g/t酶制劑)。試驗期為42 d。

1.3 樣品采集肉雞42日齡時，處死后剖檢，取十二指腸、空腸和回腸，生理鹽水沖洗后固定于10%福爾馬林溶液中。收集盲腸內容物，置于凍存管內，立即放置于液氮中，用于腸道微生物16S rRNA測序。

1.4 測定指標

1.4.1腸絨毛形態觀察及測量 各組肉雞解剖后分離腸道，取十二指腸中段、空腸中段和回腸中段各1 cm，用生理鹽水沖洗干凈，放置于10%福爾馬林溶液中固定，按常規方法制備石蠟切片，經H&E染色后，光鏡下觀察石蠟切片。使用Image J軟件對腸絨毛高度和隱窩深度進行測定。

1.4.2腸道微生物多樣性檢測 使用DNeasy PowerSoil試劑盒(QIAGEN,Inc.,Netherlands)提取盲腸內容物中總微生物基因組DNA樣本，用正向引物515F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物907R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。使用Illlumina MiSeq平臺和MiSeq試劑Kit v3進行測序。獲得的序列通過 Mothur軟件平臺，剔除低質量DNA序列后,計算序列之間的距離。每一個運算分類單元OTU代表序列相似度大于97%的DNA序列，對各試驗處理組測序結果進行菌群多樣性分析和聚類分析。

2 結果

2.1 小腸組織形態學觀察

2.1.1十二指腸組織形態學觀察 結果見圖1，十二指腸絨毛為寬的葉片狀，與MC、MS和MM組相比，MZ、MG組十二指腸的絨毛長度明顯變長。

A.MC組；B.MS組；C.MM組；D.MD組；E.MZ組； F.MG組

2.1.2空腸組織形態學觀察 結果見圖2，空腸絨毛以指狀為主，與MC、MS和MM組相比，MZ、MG組空腸絨毛長度明顯增加。

2.1.3回腸組織形態學觀察 結果見圖3，回腸絨毛為短錐狀，排列疏松，與MC、MS和MM組相比，試驗組眼觀均無明顯變化。

A.MC組；B.MS組；C.MM組；D.MD組；E.MZ組； F.MG組。

2.2 各組肉雞小腸絨毛長度和絨毛與隱窩深度的比值(V/C)

2.2.1各組肉雞小腸絨毛長度 結果見圖4， MD組的十二指腸絨毛長度顯著高于MS和MM組(P<0.05)；MZ組的十二指腸絨毛長度顯著高于MM組(P<0.05)，空腸絨毛長度顯著高于MC組(P<0.05)；MG組的十二指腸絨毛長度顯著高于MC、MS和MM組(P<0.05)。各組回腸絨毛長度無顯著性差異。

注：相同小寫字母表示無顯著性差異(P>0.05),不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2.2各組肉雞絨毛與隱窩深度的比值(V/C) 結果見圖5，MZ、MG組的十二指腸V/R顯著高于MC、MS和MM組(P<0.05)，MZ和MG組的空腸V/C顯著高于MC和MS組(P<0.05)，各組回腸V/C無顯著性差異。

圖5 中藥復合小肽對于肉雞絨毛與隱窩深度比值的影響

2.3 盲腸菌群OTU分析結果見圖6，MG組的屬水平OTU顯著高于MC組(P<0.05)，其他組屬水平OTU無顯著性差異。

圖6 屬水平OTU分析

2.4 盲腸菌群Alpha多樣性分析如圖7所示，物種積累曲線隨著測試樣本的增加逐漸變得平緩，說明樣本量已經足以反應群落的豐富度。豐度等級曲線的平緩程度反應群落的均勻度，盲腸腸道菌群的豐度等級曲線比較平緩，說明群落的均勻度比較高。

A.物種積累曲線；B.豐度等級曲線

2.5 盲腸菌群結構分析結果見圖8，門水平上，有2個菌門占比90%以上，分別是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中最多的是擬桿菌門(Bacteroidetes)，其次是厚壁菌門(Firmicutes)。MD組的盲腸擬桿菌門(Bacteroidetes)含量顯著高于MC和MS組(P<0.05)。屬水平上，MD組的盲腸糞桿菌屬(Faecalibacterium)含量顯著低于MC組(P<0.05);MD、MZ、MG、MS和MM組的盲腸乳酸桿菌屬(Lactobacillus)含量高于MC組(P>0.05)。

A.門水平分類學組成分析;B.屬水平分類學組成分析;橫坐標為該分組方案各樣本/各分組/整體的名稱；縱坐標為特定分類水平下各分類單元的相對豐度

2.6 盲腸菌群Lefse(LDA effect size)分析在MG組中具有豐度差異的微生物類群是β-變形菌門(Betaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。在MM組中具有豐度差異的微生物類群是艱難桿菌科(Mogibacteriaceae)，結果見圖9A。

MG組中具有豐度差異的微生物類群是β-變形菌門(Betaproteobacteria)和黃桿菌綱(Flavobacteriia)。β-變形菌門(Betaproteobacteria)向外映射到伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)； 黃桿菌綱(Flavobacteriia)向外映射到黃桿菌目(Flavobacteriales)，最后到黃桿菌科(Flavobacteriaceae)，結果見圖9B。

A.基于LDA值的分布直方圖；B.分類學分支圖;LDA臨界值為2

2.7 中藥復合小肽對于肉雞生產性能的影響

2.7.1中藥復合小肽對于肉雞體質量的影響 21日齡各組體質量無顯著性差異。42日齡MD組的體質量顯著高于MC和MS組(P<0.05)；MZ和MG組的體質量顯著高于MC、MM和MS組(P<0.05)(圖10)。

圖10 中藥復合小肽對21和42 d肉雞體質量的影響

2.7.2中藥復合小肽對于肉雞料肉比的影響 0～21日齡,肉雞料肉比隨著CSPCM的添加劑量的上升而減少，添加酶制劑和微生態制劑也可以降低料肉比。22～42日齡肉雞料肉比隨著CSPCM的添加而大幅減少，添加酶制劑和微生態制劑也可以降低料肉比(表1)。

表1 中藥復合小肽對肉雞料肉比的影響

3 討論

小腸是化學性消化吸收的主要器官，是蛋白質、氨基酸、淀粉、麥芽糖和葡萄糖的主要吸收部位，小腸消化功能的增強將有助于營養物質的充分吸收[8]。小腸作為營養物質吸收的重要位置，小腸絨毛高度增加可以提高小腸與腸道內容物的接觸面積，從而增加營養物質的沉積，對于提高肉雞的生產性能具有重要意義[9]。隱窩深度反映了隱窩細胞的増殖率和成熟度，隱窩變淺則分泌功能增強，絨毛上皮細胞再生能力強，更有利于維持腸道的吸收功能[10]。絨毛高度越高，與營養物質的接觸就越充分，營養物質沉積的效率就越高[11]。本試驗結果表明，與MC組相比，添加CSPCM的MZ、MG組能夠提高十二指腸和空腸的絨毛長度和V/C值，而MM組和MS組的絨毛長度和V/C值都無顯著性提高。可以初步判斷，中、高劑量的CSPCM能夠促進營養物質的轉運和吸收，增強腸道功能，提高肉雞生產性能。

研究表明，肉雞腸道菌群門水平上豐度較高的菌群是擬桿菌門和厚壁菌門(>90%)，其他研究對雞盲腸菌群的研究結果類似[12-14]。本試驗中門水平豐度最高的是擬桿菌門。已有研究表明，屬水平上，瘤胃球菌、乳桿菌、梭狀芽孢桿菌和擬桿菌屬在雞腸道中豐度在70%以上[12,15]，是主要菌屬。在本試驗中豐度最高的是另枝菌屬(Alistipes),然后是糞桿菌屬(Faecalibacterium),其次是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，與前人研究結果不同。在試驗中出現這些差異的原因可能主要與飼料成分有關。已有研究表明，在飼料中添加中藥、酶制劑和微生態制劑都能夠增加腸道內乳酸菌等有益菌的占比[16-18]，本研究對中藥復合小肽、酶制劑和微生態制劑改善腸道菌群的效果進行了對比。發現在飼料中添加中藥復合小肽、酶制劑和微生態制劑能夠提高腸道內乳酸桿菌的含量，與飼料轉化率值較高的肉雞品系相比，飼料轉化率值較低的雞在糞便樣品中顯示出了較高的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度[19]，說明在飼料中添加CSPCM、微生態制劑和酶制劑均能不同程度促進肉雞的消化吸收。

Lefse(LDA effect size)用于分析各組在統計學上有差異的生物標志物，來分析組間有顯著性差異的物種。本試驗結果顯示在MG組具有豐度差異的物種是伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。伯克霍爾德菌(Burkholderiales)能產生多種具有抗菌活性的代謝產物如鐵載體(pyochenlin、pyoverdine)和單萜生物堿等[20]，而黃桿菌科(Flavobacteriaceae)可發酵葡萄糖、果糖和麥芽糖，能夠幫助宿主消化吸收，從而促進生長[21]。

肉雞作為一種經濟動物，飼料添加劑對于生產性能的改善是尤為重要的。隨著在飼料中CSPCM添加劑量的上升，對于肉雞體質量和料肉比的改善越發明顯，結合小腸絨毛長度與隱窩深度的比值發現其趨勢一致，說明CSPCM的添加可能是通過增加絨毛長度和降低隱窩深度進行作用的。CSPCM對于肉雞生產性能的改善也讓其更具有了實際應用的意義。在飼料中添加中、高劑量的CSPCM可以通過增加十二指腸和空腸的絨毛長度、V/C值、盲腸內有益菌含量和降低料肉比來促進肉雞生長。低劑量的CSPCM可以通過增加盲腸內擬桿菌門菌群豐度來促進營養物質消化吸收。

綜上所述，在飼料中添加CSPCM能夠改善盲腸菌群。在飼料中添加高劑量CSPCM有利于肉雞小腸發育從而達到促進肉雞生長的效果是最好的，并且其促生長效果優于微生態制劑和酶制劑。