蟬花多糖對肉雞生長性能、抗氧化能力和腸道菌群的影響

李瑞萍，劉長國，張 碩，董麗艷，王秋霞，徐時湘，李國勤，田 勇，柴一秋，劉素貞*，盧立志*

(1．浙江農(nóng)林大學 動物科技學院，浙江 杭州 311300；2.溫州科技職業(yè)學院 動物科學學院，浙江 溫州 325000；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；4.浙江省亞熱帶作物研究所 溫州市蟲生真菌資源研究與開發(fā)重點實驗室，浙江 溫州 325005)

隨著消費者越來越關(guān)注肉品質(zhì)的健康與安全[1-2]，同時我國減抗、禁抗政策逐漸完善，尋找新型綠色飼料添加劑成為研究熱點。蟬花多糖屬于我國傳統(tǒng)型中藥的提取物，多糖能通過調(diào)節(jié)腸道菌群和影響機體免疫系統(tǒng)達到加強機體健康水平的目的[3-4]。蟬花多糖起到抗氧化[5]、抑菌作用[6]、提高肉雞體質(zhì)量、飼料利用率[7]等作用。目前，蟬花多糖在小鼠上的研究更為集中，蟬花多糖用于雞的應(yīng)用研究鮮有報道，本課題組前期研究了蟬花多糖對肉雞免疫、生長發(fā)育的影響[7-8]。本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上，將更全面的探討雞養(yǎng)殖中蟬花多糖在提高雞的生長性能、增強抗氧化水平和保護腸道菌群方面的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料蟬花多糖由浙江省亞熱帶作物研究所自蟬花蟲草子實體經(jīng)過多層工藝制得[9];桿菌肽鋅(批號：P181013)，由綠康生化有限公司提供;雞新城疫活疫苗LaSota株，由博美萊生物制品有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計將270只1日齡雁蕩麻雞[10](浙江綠雁有限公司提供)隨機分為6組，分別用A、B、C、D、E、F表示，每組3個重復，每個重復15只，公母各半。在11～17日齡和25～31日齡，按照表1方案進行灌服，1次/d。其中B～F組(免疫) 在14，28日齡用新城疫弱毒疫苗點眼免疫，A組(非免疫)用等量生理鹽水點眼。

表1 雁蕩麻雞灌服添加劑成分及劑量

1.3 飼養(yǎng)管理試驗于2019年5月在溫州種子種苗科技園進行，試驗期從1日齡開始，42日齡結(jié)束。試驗雞采用雙層立體籠養(yǎng)，自由采食(無抗基礎(chǔ)日糧由溫州正泰農(nóng)牧有限公司提供，日糧組成及營養(yǎng)成分見表2)、飲水，采用自然光照和通風。每日準時打掃衛(wèi)生，觀察試驗雞精神和健康狀況。

表2 無抗基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平 %

1.4 測定指標及方法

1.4.1生長性能測定 每天記錄投料量、剩余料量和采食量，分別于8，28，42日齡早9:00測量每個重復試驗雞空腹時的體質(zhì)量，并計算平均日增體質(zhì)量(ADG)、料重比(F/G)。

1.4.2血清生化指標測定 于試驗雞42日齡，分別從每個重復中任選6只雞，進行靜脈采血，分離血清并在-20℃保存。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)采用北京華英生物技術(shù)研究所的比色試劑盒，A6半自動生化儀(北京松上技術(shù)有限公司)測定。

1.4.3糞便菌群結(jié)構(gòu)分析 在試驗雞42日齡，隨機選取B、C、E、F組每個重復2只，每組共6只(其中E組5只)，處死后取盲腸內(nèi)容物至無菌凍存管，迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。使用power soil DNA isolation Kit試劑盒(MOBIO Laboratories)從雞的盲腸內(nèi)容物中提取總細菌DNA。通過D260/D280的比值評估DNA質(zhì)量和數(shù)量,1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，然后將DNA暫存在-80℃待處理。用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌 16S rRNA 基因的 V3～V4 區(qū)域。PCR 擴增體系(50 μL)包含10 μL Buffer，10 μL高GC增強劑，1 μL dNTP，0.2 μL Q5高保真DNA聚合酶，10 μmol/L 引物及60 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃ 1 min，15個循環(huán)；72℃延伸7 min。第一步PCR產(chǎn)物通過VAHTSTM DNA Clean Beads純化。第2步PCR在40 μL反應(yīng)體系中進行，包含20 μL 2×Phusion HF MM，8 μL ddH2O，第一步10 μL PCR的產(chǎn)物和10 μmol/L每種引物。反應(yīng)條件如下：初始變性在98℃ 30 s，98℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，10個循環(huán);72℃延伸5 min。最后通過Quant-iTTMdsDNA HS試劑定量所有PCR產(chǎn)物并把其合并在一起;由中國北京百邁客生物科技有限公司使用Illumina Hiseq 2500平臺(PE250)對純化的混合樣品進行細菌rRNA基因的高通量測序分析。

4.2 植株調(diào)整：當植株高30厘米或出現(xiàn)卷須時要及時搭架引蔓，引蔓最好在下午進行，以免損傷莖蔓。引蔓和綁蔓使其莖葉分布均勻，苦瓜有很強的分枝能力，若任其生長，則會造成枝葉過分茂密，消耗養(yǎng)分，且植株間透氣性差，易發(fā)生病蟲害，也會影響主蔓的正常生長和開花結(jié)果，因此，在上架同時，將棚架以下的側(cè)枝全部摘除，保證培育健壯的主蔓，在主蔓上架以后，適當選留中上部強壯的側(cè)蔓，以提高產(chǎn)量。在旺盛生長期，枝葉繁茂，要及時摘除植株下部的黃葉和病葉，保證通風透光，延長采收時間，提高產(chǎn)量和質(zhì)量。

糞便菌群結(jié)構(gòu)分析使用USEARCH軟件[11]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類獲得OTU，并基于Silva(細菌)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。使用QIIME軟件進行 Beta 多樣性(Beta diversity)分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度?；贐eta多樣性分析得到的4種距離矩陣，使用R語言工具分別繪制PCoA分析。

2 結(jié)果

2.1 蟬花多糖對雁蕩麻雞生長性能的影響由表3可知，28日齡時， E組體質(zhì)量顯著高于A～C組(P<0.05)，F(xiàn)組體質(zhì)量高于B、C組，C組體質(zhì)量低于A組，但差異不顯著(P>0.05)；42日齡時，E、F組體質(zhì)量高于A、B組，且A、B組體質(zhì)量高于C組，其中E組體質(zhì)量顯著高于B、C組(P>0.05)。

表3 各組雁蕩麻雞體質(zhì)量測定表 g

由表4可知，整個試驗期E組ADG和F/G均優(yōu)于A、C組。其中8～28日齡，E組ADG、F/G優(yōu)于A～C組，且ADG顯著優(yōu)于B、C組(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著低于A～C組(P<0.05)，A組ADG、F/G優(yōu)于B、C組(P>0.05)；29～42日齡，D～F組ADG高于A、C組，且E、F組顯著高于C組(P<0.05)，D、F組F/G低于A～C組，且D組顯著低于C組(P<0.05)，E組F/G低于B、C組(P>0.05)，A、B組ADG、F/G優(yōu)于C組，且B組ADG顯著高于C組(P>0.05)；D～F組全期ADG高于B、C組，其中E組全期ADG高于其余各組且顯著高于B組(P<0.05)，同時，A組全期ADG高于B、C組，但差異不顯著(P>0.05)；D～F組全期F/G低于A～C組，且D、F組顯著低于C組(P<0.05)，A、B組全期F/G低于C組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 蟬花多糖對雁蕩麻雞生長性能的影響

2.2 蟬花多糖對雁蕩麻雞血清抗氧化水平的影響由表5可知，D～F組血清中T-AOC、SOD、GSH-PX含量高于A～C組，其中D、E組T-AOC、SOD含量顯著高于A、C組(P<0.05)，GSH-Px含量顯著高于A～C組(P<0.05)，F(xiàn)組T-AOC含量顯著高于A～C組，SOD含量顯著高于C組，GSH-Px含量顯著高于A、B組(P<0.05)，同時，A、B組T-AOC、SOD含量顯著高于C組(P<0.05)；E、F組血清中CAT含量高于A～C組，但無顯著性差異(P>0.05)。

表5 蟬花多糖對雁蕩麻雞血清抗氧化水平的影響 U/mL

2.3 蟬花多糖對雁蕩麻雞腸道菌群的影響

2.3.1蟬花多糖對雁蕩麻雞腸道微生物的影響 23個樣品測序共獲得1 805 666對Reads，雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生1 628 985條Clean tags，每個樣品至少產(chǎn)生47 746條Clean tags，平均產(chǎn)生70 825條Clean tags。如圖1所示，每組樣品稀釋曲線趨于平緩，表明實際測序深度基本覆蓋微生物群落多樣性[12]。

圖1 樣本稀釋曲線

2.3.2蟬花多糖對雁蕩麻雞腸道微生物α多樣性的影響 由表6可知，E、F組較B、C組物種數(shù)量有所增加，且顯著高于C組(P<0.05)，同時B組物種數(shù)量也多于C組，但無顯著性差異(P>0.05)；F組中物種多樣性顯著高于B、C組(P<0.05)，E組中物種多樣性顯著高于B組(P<0.05)，B與C組之間的物種多樣性無顯著性差異(P>0.05)。

表6 雁蕩麻雞腸道微生物α多樣性

圖2 β多樣性

2.3.4蟬花多糖對雁蕩麻雞腸道微生物門水平和屬水平的影響 在門水平上和屬水平上分別以微生物豐度TOP10的菌屬作為各組的優(yōu)勢菌群進行分析。如圖3所示，在門水平上，雁蕩麻雞腸道內(nèi)微生物沒有顯著性差異(圖3A)，但在屬水平上(圖3B)，與B、C組相比，E組擬桿菌屬(Bacteroides)分別增加了26.27%,26.22%，F(xiàn)組擬桿菌屬分別增加34.92%,34.88%，E組糞桿菌屬(Faecalibacterium)比C組增加了9.24%。

圖3 門水平和屬水平上微生物分布柱狀圖

2.3.5Lefse分析 通過Lefse分析設(shè)LDA閥值為4.0，進一步比較不同組間之間具有差異的腸道菌群[13]。由圖4所示，與免疫對照組和抗生素對照組相比，在E組中富集的biomaker主要有：擬桿菌屬(Bacteroides)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、梭菌屬(Fusobacterium)，F(xiàn)組富集的biomaker主要包括：巨單胞菌屬(Megamonas)、Negativicutes綱、Selenomonadales目、韋榮菌科(Veillonellaceae)。

2.3.6KEGG功能預(yù)測 針對KEGG代謝途徑差異的分析，比較抗生素對照組和蟬花中高劑量組(50,100 mg/kg)在微生物群落功能基因的差異，如圖4所示。結(jié)果表明，E、F與C組相比差異功能通路分別為16，2個，其中E組中的輔助因子和維生素的代謝、細胞群落-原核生物、細胞活性、折疊、分類和降解、免疫系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)等通路相對豐度高于C組，F(xiàn)組中核苷酸代謝、消化系統(tǒng)通路高于C組。

c.綱；o.目；f.科；g.屬；s.種

圖5 抗生素對照組和蟬花中高劑量組KEGG代謝途徑差異

3 討論

3.1 蟬花多糖對雁蕩麻雞生長性能的影響體質(zhì)量、ADG、F/G等指標可以直觀反映畜禽生長性能[14]。KOH等[15]報道服用冬蟲夏草菌絲提取物的肉仔雞體質(zhì)量較服用抗生素的肉仔雞的體質(zhì)量有顯著提高。同樣，蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物也能顯著增加肉仔雞的采食量和體質(zhì)量[16]。本研究飼喂蟬花多糖試驗雞的體質(zhì)量、ADG及F/G都得到了不同程度地優(yōu)化，在28，42日齡均以添加50 mg/kg蟬花多糖試驗雞的體質(zhì)量增加最為顯著，并顯著高于免疫對照組和抗生素對照組；表明蟬花多糖與這些蟲草添加劑效果相似，對雞的生長性能都有促進作用。

本試驗結(jié)果顯示，在肉雞生長階段中添加50 mg/kg 的蟬花多糖能更有效增加肉雞ADG，降低F/G。申遠航等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬生長發(fā)育中飼喂中草藥在ADG方面顯著優(yōu)于抗生素，這與本試驗結(jié)論相似，飼喂50 mg/kg的蟬花多糖的肉雞ADG顯著優(yōu)于抗生素對照組。孫甜甜等[18]的研究中枸杞粗多糖顯著增高了22～42日齡肉仔雞的ADG且降低了F/G。蟬花多糖作為真菌提取物，在機體內(nèi)與機體產(chǎn)生相互作用，由此提高雞的體質(zhì)量、增加ADG及降低F/G，其作用機制尚未有更深入的研究，但其應(yīng)用效果已經(jīng)得到部分證實。

3.2 蟬花多糖對雁蕩麻雞血清抗氧化水平的影響GSH-Px、SOD是機體主要的抗氧化酶，維持細胞膜的穩(wěn)態(tài)，均能清除體內(nèi)自由基[19-20]。T-AOC則代表了動物體的抗氧化能力[21]。植物多糖能提高GSH-Px、SOD、CAT的活性從而減少機體內(nèi)過氧化產(chǎn)物的含量[22]。過量的活性氧在機體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物從而危害機體健康[23]。綜合本次對血清抗氧化指標的研究結(jié)果，灌喂蟬花多糖50 mg/kg的試驗雞血清中T-AOC、SOD、GSH-Px都得到了有效提高，證明蟬花多糖該劑量抗氧化水平最佳。這與丁浩軒等[24]的研究相似，杜仲提取物(多糖、黃酮類化合物等)顯著提高了肉雞血清中GSH-Px、T-AOC、SOD等水平，植物多糖添加劑不僅加強機體對活性氧自由基的清除能力，而且機體血清內(nèi)抗氧化酶活性的提升有助于抑制脂質(zhì)過氧化。三七多糖可以清除DPPH和ABTS自由基，在抗氧化能力方面有良好的表現(xiàn)[25]。說明植物中的多糖成分是非常有效的抗氧化劑來源[26]。

3.3 蟬花多糖對雁蕩麻雞盲腸菌群多樣性的影響腸道菌群是機體對抗疾病的主要防御成分之一[27]。在眾多對腸道菌群產(chǎn)生影響的因素中，飲食對機體腸道微生物菌群的多樣性起到重要作用。盲腸是雞體內(nèi)微生物最密集的場所，其微生物多樣性遠高于上消化道[28]。Chao1、Ace指數(shù)是α多樣性中常用于度量微生物豐度，Shannon數(shù)值越高，Simpson數(shù)值越低，則物種多樣性越豐富[29]。本試驗結(jié)果表明飼喂蟬花多糖的試驗雞腸道微生物α多樣性更為豐富，同時，免疫對照組、抗生素對照組、蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)和蟬花多糖高劑量組(100 mg/kg)之間的β多樣性也存在顯著性差異。

擬桿菌屬類屬于擬桿菌門，糞桿菌屬則類屬于厚壁菌門。擬桿菌屬具有降解植物多糖的能力[30]，同時會改善腸道環(huán)境使其更適合與其他腸道菌群生存[31]。腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等，起到維持腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道水電解質(zhì)平衡等作用[32]。擬桿菌屬通過在腸道中產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，從而提高腸道代謝功能[33]。糞桿菌屬是丁酸鹽的生產(chǎn)者[34]，丁酸鹽能夠協(xié)調(diào)機體抵御外來病原體入侵，降低機體炎癥反應(yīng)，其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制是通過上調(diào)抗菌肽的表達[35]。丁酸鹽在維持機體氧化還原平衡中也起到了重要作用[36]，蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)中試驗雞腸道內(nèi)的糞桿菌屬高于抗生素對照組，這可能也是飼喂蟬花多糖的試驗雞在抗氧化能力中顯著優(yōu)于空白對照組、免疫對照組及抗生素對照組的因素之一。隨著擬桿菌門和厚壁菌門比例的升高，機體脂肪代謝能力也隨之發(fā)生改變，機體脂肪更容易蓄積[37]。蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)中擬桿菌屬和糞桿菌屬比例比抗生素對照組高，所以添加蟬花多糖(50 mg/kg)的試驗雞在生產(chǎn)性能方面表現(xiàn)的更為突出可能是因為該試驗組中的試驗雞腸道菌群促使宿主在食物中獲取更多能量。短鏈脂肪酸還能促進腸肽分泌，增加機體飽腹感從而減少食量[38]，這也可能是飼喂蟬花多糖的試驗雞F/G較低的原因之一。盡管如此，肉雞腸道內(nèi)的微生物群落和菌群的比例依然會隨著年齡、飲食和添加劑、環(huán)境等因素不斷的變換[39]。探究腸道微生物對機體生長性能、抗氧化等方面產(chǎn)生的影響，還需要進一步驗證。

抗生素可以廣泛但不可精確地調(diào)節(jié)微生物群，抗生素的攝入擾亂了腸道微生物群落的穩(wěn)定，從而使得病原菌更容易侵襲機體[40]。在本試驗條件下，飼料添加劑的改變雖然不會大幅度改變門水平上腸道菌群分類水平，但會影響分類級別較低的綱、目、科、屬等水平的豐度。通過蟬花多糖對雁蕩麻雞中關(guān)鍵菌群的影響發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵菌群大多屬于擬桿菌門(Bacteroides、Bacteroidaceae)、厚壁菌門(Fusobacterium、Negativicutes綱、Selenomonadales目、Vei-llonellaceae)。綜合蟬花多糖對雁蕩麻雞生長性能、抗氧化、Lefse的分析，由此推測，增多的Bacteroides、Bacteroidaceae、Fusobacterium是造成蟬花多糖中劑量組的試驗雞在生產(chǎn)性能、抗氧化方面更具優(yōu)勢的關(guān)鍵菌群，而增多的Megamonas、Negativicutes綱、Selenomonadales目、Veillonellaceae可能是使蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)在生產(chǎn)性能、抗氧化方面表現(xiàn)優(yōu)良的關(guān)鍵菌群。

在KEGG代謝途徑功能預(yù)測中，蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)與抗生素對照組相比腸道微生物群落的功能基因在輔助因子和維生素的代謝、免疫系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)等代謝途徑上存在顯著性差異；蟬花多糖高劑量組(100 mg/kg)與抗生素對照組之間腸道微生物群落中的核苷酸代謝、消化系統(tǒng)的相對豐度增加。再次說明，適宜劑量的蟬花多糖能夠?qū)δc道菌群起到調(diào)節(jié)作用，且體現(xiàn)在微生物多樣性、豐度、結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵菌群等多方面。由此推測蟬花多糖可能是通過上調(diào)這些通路中的基因，改善菌群的新陳代謝，提高其對環(huán)境的適應(yīng)能力及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，但基于通路探討蟬花多糖的作用還需要通過代謝組學等進一步研究。

添加蟬花多糖能提高雁蕩麻雞體質(zhì)量、ADG，降低F/G，并提高雁蕩麻雞血清抗氧化水平，在一定程度上能影響雞腸道微生物菌群多樣性，從而提高機體健康水平。本試驗條件下，蟬花多糖中劑量組(50 mg/kg)效果最佳。