牛奶淀粉樣蛋白A的原核表達及單克隆抗體制備

張正榮，郭晨瑤，陳詩勝，趙亞男，任建鸞，湯 芳，薛 峰*，戴建君,2

(1.南京農業大學 動物健康與食品安全國際合作實驗室，江蘇 南京210095；2.中國藥科大學 藥學院，江蘇 南京 211198)

奶牛乳腺炎(bovine mastitis)又稱為奶牛乳房炎，是一種影響奶牛健康的主要疾病，乳腺炎導致牛奶產量減少、治療開支負擔加重，嚴重時會導致奶牛被淘汰，對養殖業、乳品業造成巨大的經濟損失[1-3]。乳腺炎通常通過諸如加利福尼亞乳腺炎測試(CMT)、對體細胞計數(SCC)的實驗室分析或乳汁病原微生物檢測法來診斷[4-5]。乳汁病原微生物檢測法是目前對于奶牛乳房炎檢測的“金標準”，缺點在于該方法較為復雜繁瑣、耗時較長、成本較高,急需研究和開發更加靈敏可靠的奶牛乳腺炎預測生物標志物。目前，乳汁急性期蛋白、乳酶、乳成分等指標，以及血常規指標已經成為這方面的研究熱點[6]。

急性期反應期蛋白(acute phase protein,APP)是在壓力、外傷、感染或炎癥等刺激激發動物機體產生的早期蛋白[7-8]。血清淀粉樣蛋白A(SAA)是一種具有多種蛋白質種類的APP，主要在肝臟遭受急性刺激時產生，它的主要同種型為SAA1、SAA2和SAA3，其中SAA1和SAA2主要在肝臟中產生，而SAA3在肝外部位產生，且主要在牛奶中發現，被稱為乳腺相關淀粉樣蛋白A(M-SAA3)[9]。SAA和M-SAA3一起被稱為牛奶淀粉樣蛋白A(MAA)，可在牛奶樣品中進行測量。目前研究發現，在奶牛發生隱性乳腺炎期間，奶牛乳中MAA含量顯著升高，牛奶中這種蛋白質的水平可作為奶牛乳腺炎感染的敏感指標[10-13]。目前對于奶牛中MAA的相關研究與檢測較少，現有的成熟的檢測方法只有ELISA法[14-15]。為了進一步深入研究奶牛乳腺炎檢測技術以及MAA的免疫學功能，制備具有免疫原性的MAA蛋白以及單克隆抗體，對于開展后續研究具有重要意義。

本試驗從NCBI上查閱MAA基因序列并進行密碼子優化后合成質粒，以pET28a-SUMO作為載體構建pET-28a-SUMO-MAA重組表達質粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，IPTG誘導表達，優化表達條件以獲得最大量可溶性融合蛋白。利用SUMO酶切除SUMO標簽獲得具有完全反應原性的MAA蛋白。以純化后的MAA蛋白免疫小鼠并制備單克隆抗體，通過ELISA測定其效價，Western blot測定抗體特異性，為后續MAA檢測方法及奶牛乳腺炎的診斷研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、質粒pET28a-SUMO載體購自淼靈質粒平臺；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態菌株均購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 試劑與儀器所有引物均由南京擎科生物科技有限公司合成；限制性核酸內切酶BamHⅠ、SacⅠ、Exnase連接酶均購自TaKaRa公司；2×Phanta?Max Master Mix以及2×Taq Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；His-1694、His-1683蛋白來自本實驗室表達并保存；BSA購自南京鼎思生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自美國OMEGA公司；SDS-PAGE蛋白預制膠購自金斯瑞生物科技有限公司；PageRuler蛋白預染Marker為賽默飛公司產品；SUMO酶購自通用生物系統(安徽)有限公司；SPF級BALB/c小鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司；Protein A填料純化試劑盒、BCA法蛋白質濃度測定試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Ni2+親和層析柱、 AKTA pure蛋白純化儀購自美國GE公司。

1.3 重組融合蛋白質粒的構建根據GenBank上的MAA基因序列(GenBank登錄號：AF540564.1)由金斯瑞生物科技有限公司進行合成，片段大小為396 bp。根據pET28a-SUMO載體序列以及BamHⅠ、SacⅠ酶切位點設計引物，由南京擎科生物科技有限公司合成MAA鑒別引物以及同源臂引物(表1)。按照質粒提取試劑盒抽提pET28a-SUMO質粒并對其進行BamHⅠ、SacⅠ雙酶切，回收載體大片段；使用同源臂引物、高保真酶PCR預混液擴增MAA序列后回收PCR產物。將2組分按照同源重組試劑盒說明加入Exnase重組酶37℃連接30 min，取10 μL連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用含卡那霉素(50 mg/L)的LB瓊脂糖平板篩選陽性克隆菌株，對陽性克隆菌株進行菌液PCR鑒定，選取PCR鑒定正確的克隆抽提質粒，BamHⅠ、SacⅠ雙酶切鑒定后進一步測序驗證。PCR擴增體系共50 μL：PCR預混液25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，加ddH2O 19 μL。PCR反應條件：95℃ 預變性 5 min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，擴增30個循環；最后72℃延伸10 min。

表1 引物序列及相關信息

1.4 重組表達菌株的制備及預表達將測序正確的pET28a-SUMO-MAA質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，37℃培養至D600 nm為0.6～ 1.0，加入1.0 mmol/L的IPTG誘導表達8 h,誘導后的菌液8 000 r/min離心10 min，用PBS洗3次，重懸菌液后，提取蛋白，通過SDS-PAGE分析表達結果。

1.5 誘導條件的優化

1.5.1誘導溫度的選擇 制備等量表達菌液3管，37℃培養至D600 nm值0.6，加入1.0 mmol/L的IPTG后分別置于16，28，37℃誘導表達8 h,離心后以5 mL的PBS重懸，各自超聲破碎后12 000 r/min離心30 min收集上清和沉淀，SDS-PAGE和Western blot分析不同溫度下目的蛋白SUMO-MAA的表達情況，為制備可溶性表達的天然蛋白，選擇上清表達量最大的誘導溫度。

1.5.2誘導時間的選擇 制備等量的表達菌液6管，37℃培養至D600 nm值0.6，加入1 mmol/L的IPTG后選擇優化的溫度誘導表達，分別誘導表達3，5，7，10，12 h，超聲破碎后離心收集上清，SDS-PAGE分析不同誘導時間SUMO-MAA的可溶性表達情況。

1.5.3誘導劑IPTG濃度的選擇 制備5管等量的表達菌液，37℃培養至D600 nm值0.6，分別加入0.3，0.5，0.8，1.0，2.0 mmol/L的IPTG誘導表達，選擇優化后的溫度以及最佳誘導時間，離心收集上清，SDS-PAGE分析目的融合蛋白的表達量。

1.6 MAA的大量表達與純化

1.6.1SUMO-MAA的表達與純化 按照優化后的條件培養表達菌液3 L，離心收集菌體，PBS洗3次后在上清Binding Buffer(20 mmol/L咪唑、20 mmol/LNa3PO4、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、0.2% Tween-20)中重懸，超聲破碎完全后離心收集上清，在1 mL鎳離子親和層析柱上利用AKTA pure蛋白純化儀純化目的蛋白。系統設置A液(20 mmol/L Na3PO4、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、0.2% Tween-20)與B液(1 mol/L咪唑、20 mmol/L Na3PO4、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、0.2% Tween-20)混合比例來設置梯度咪唑洗脫程序，對出峰位置進行SDS-PAGE分析以選擇最佳的咪唑洗脫濃度。將收集到的SUMO-MAA融合蛋白透析，選擇截留相對分子質量為7 kDa的透析袋，在PBS中4℃透析12 h，每3 h更換1次透析液，透析結束后以截留相對分子質量為3 kDa的超濾管濃縮，BCA法測蛋白濃度后保存。

1.6.2MAA蛋白純化 以SUMO酶對SUMO-MAA進行酶切，每100 μg蛋白以5 U的SUMO酶于4℃酶切16 h。酶切后產物過鎳柱并收集流出液進行SDS-PAGE分析，將收集到的MAA蛋白測濃度后于-40℃保存待用。

1.7 MAA單克隆抗體的制備將純化后的重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合至乳化狀態，以皮下多點注射的方式免疫6周齡BALB/c雌鼠。免疫程序如表2所示。選擇免疫性較好的小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0進行融合篩選能夠分泌單克隆抗體的融合細胞株。對8～10周齡BALB/c雌鼠腹腔注射融合細胞懸液，收集腹水，以Protein A親和層析預裝柱純化抗體并采用間接ELISA法對其進行效價檢測和特異性測定。

表2 免疫程序

2 結果

2.1 重組表達質粒的PCR及雙酶切鑒定利用MAA特異性引物對pET28a-SUMO-MAA進行PCR鑒定，PCR擴增結果如圖1A所示，目的片段大小396 bp與預期相符。圖1B為重組質粒的雙酶切鑒定，結果顯示酶切后質粒由螺旋形變為線形，在396 bp出現目的基因條帶，重組質粒測序結果顯示目的基因連接成功并且與GenBank上的MAA基因序列同源性為100%，表明重組表達質粒構建成功。

A．重組質粒的MAA基因PCR擴增結果;M1.DL2000 DNA Marker；1～2.MAA 基因PCR擴增產物；3.空白對照；B.重組質粒雙酶切鑒定；M2.DL5000 DNA Marker；4.酶切前的重組質粒；5.酶切后的重組質粒

2.2 融合蛋白的誘導表達將測序正確的菌株經IPTG誘導后，與未誘導以及空載體進行SDS-PAGE對照分析，結果如圖2所示，重組表達菌株pET28a-SUMO-MAA-BL21誘導后在35 kDa左右出現目的SUMO-MAA融合蛋白條帶。未誘導的表達菌株同樣在35 kDa處出現蛋白條帶，說明在未誘導的菌株存在本底表達，由于炎癥因子對菌體的毒性作用，蛋白表達量較少。空載體誘導前后和BL21產物在35 kDa均無目的條帶。

M．PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1.pET28a-SUMO-MAA誘導表達產物；2.pET28a-SUMO-MAA未誘導產物；3.pET28a-SUMO誘導表達產物；4.pET28a-SUMO未誘導產物；5.BL21產物

2.3 誘導條件的優化

2.3.1誘導溫度的選擇 研究表明，低溫條件有利于大腸桿菌誘導表達重組融合蛋白，提高蛋白質穩定性，然而，誘導溫度降低又極大限制了宿主菌的生長，導致蛋白質總體產量下降[16]。本試驗選擇3個常用表達溫度16，28，37℃作為優化條件，如圖3所示，SDS-PAGE結果顯示在其他表達條件相同的情況下，融合蛋白在16℃上清表達量最多，Western blot顯示相同結果，所以選擇16℃為表達溫度。

A．不同誘導溫度下的SDS-PAGE結果；B.不同誘導溫度下的Western blot結果；M.PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1.16℃誘導上清樣品；2.16℃誘導沉淀樣品；3.28℃誘導上清樣品；4.28℃誘導沉淀樣品；5.37℃誘導上清樣品；6.37℃誘導沉淀樣品

2.3.2誘導時間的選擇 從圖4可以看出，在其他誘導條件相同的情況下，誘導時間為7 h時融合蛋白的表達量相對最多，時間過長時蛋白表達量雖然增多，但由于MAA蛋白的毒性作用導致菌體裂解，相同體積菌液的蛋白量也相對減少，所以最終選擇7 h為最佳誘導時間。

M.PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1～5.分別是3，5，7，10，12 h誘導時間下融合蛋白的表達產物

2.3.3誘導劑IPTG濃度選擇 IPTG作為乳糖類似物，在誘導蛋白表達的同時也會對菌體帶有毒性作用[17]。根據蛋白的相對表達量、穩定性以及SDS-PAGE結果，最終選擇0.5 mmol/L的IPTG(圖5)。

M.PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1～5.分別為0.3，0.5，0.7，1.0，2.0 mmol/L IPTG誘導下的蛋白表達

2.4 MAA蛋白的純化

2.4.1SUMO-MAA融合蛋白純化 通過鎳柱以及AKTA pure蛋白純化儀對融合蛋白進行純化，從蛋白純化儀峰圖(圖6A)以及出峰位置洗脫液的SDS-PAGE(圖6B)分析可以看出，在咪唑濃度高于0.30 mol/L便可洗出目的蛋白，所以將washing buffer及elution buffer的咪唑濃度分別設置為0.20，0.50 mol/L。分別收集蛋白原液、蛋白樣品流出液、washing buffer流出液、elution buffer蛋白洗脫液進行SDS-PAGE分析，結果如圖6C所示，樣品流出液里基本不存在目的蛋白，說明融合蛋白已大部分結合在鎳柱上；washing buffer流出液也基本未出現目的蛋白條帶，而蛋白洗脫液出現明顯目的蛋白條帶，說明所選擇的washing buffer與elution buffer比較合適。

A.不同濃度咪唑蛋白洗脫液洗脫的蛋白峰圖；B.不同濃度咪唑蛋白洗脫液洗脫的蛋白SDS-PAGE結果；M.PageRuler 蛋白Marker；1～6.分別為0.15，0.20，0.30，0.40，0.45，0.50 mmol/L咪唑蛋白洗脫液流出產物；C.融合蛋白純化情況;7.純化前蛋白樣品;8.樣品流出液;9.washing buffer流出液;10.蛋白洗脫液

2.4.2融合蛋白的酶切及純化 將得到的融合蛋白經SUMO酶切后過鎳柱再次純化，帶有His標簽的SUMO蛋白以及SUMO酶與鎳柱結合，無His標簽的MAA蛋白流出鎳柱。將酶切前后的樣品和過鎳柱后的樣品進行SDS-PAGE分析，結果如圖7所示，酶切后的蛋白液過鎳柱后其流出液中基本只含有17 kDa的MAA蛋白，純度達90%以上。

M.PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1.酶切前樣品；2.酶切后樣品；3.過鎳柱純化后樣品

2.5 MAA單克隆單體的制備

2.5.1單克隆抗體的純化 結果共篩選到了2株分泌單克隆抗體的融合細胞株，命名為3G11、8E10。Protein A純化腹水后SDS-PAGE分析，如圖8所示，純化后蛋白膠上出現2條帶，分別為單克隆抗體的輕鏈和重鏈。間接ELISA法測得效價分別為1∶25 600和1∶51 200，表明單克隆抗體制備成功。

M.PageRuler蛋白質相對分子質量Marker；1.3G11純化前；2.3G11純化后；3.8E10純化前；4.8E10純化后

2.5.2單克隆抗體特異性測定 分別以相同濃度的MAA、BSA以及His-1694、His-1683為包被抗原，ELISA測定結果如圖9所示，抗體3G11與8E10與MAA反應的D450 nm值均達0.9以上，而與其他干擾蛋白均小于0.4，證明抗體特異性較好。

圖9 2株單克隆抗體特異性測定結果

3 討論

乳業參與者都深知奶牛乳腺炎所帶來的經濟損失和對牛奶質量的負面影響，因此盡早地發現乳腺炎是現存檢測方法面臨的挑戰。目前存在幾種乳腺炎指示標志包括體細胞數(SCC)、酶活性、電導率以及pH，一些研究還發現SCC受多種因素影響包括動物壓力、營養、泌乳階段、胎次和所采樣牛奶的質量[19]。其他方法大多存在不穩定性和對低SCC敏感度低等缺點，并且溫度、環境等能很大程度上影響酶活性。牛奶血清淀粉樣蛋白A(MAA)在炎癥階段明顯升高，能夠有效指示隱性奶牛乳腺炎且不受其他條件的影響。MAA作為奶牛乳腺炎生物標志物已得到證實，早在2001年研究發現MAA對于區分健康奶牛和乳腺炎奶牛有重要價值，在牛奶中的敏感性和特異性分別為93%和100%[18-19]。MAA在人類醫院臨床診斷方面已達成熟，但對于奶牛方面的研究較少，為了進一步深入研究MAA的機理、檢測方法等，獲得天然活性蛋白及其單克隆抗體具有重要意義。

本研究使用目前應用最廣的大腸桿菌原核表達系統對MAA進行表達。SUMO化修飾可以保持融合蛋白基因的穩定性，使多肽正常折疊，能夠促使融合蛋白可溶性表達[20]，同時SUMO 酶可以高效地將SUMO從融合蛋白上切除[21]，因此，我們在構建重組表達質粒的時候引入SUMO基因獲得可溶性融合蛋白，再利用SUMO酶切除制得天然型MAA蛋白。在對融合蛋白表達溫度、誘導時間、IPTG濃度進行優化后進行大量表達，利用鎳親和層析柱獲得純度高、均一性好的MAA蛋白。同時將制備的MAA蛋白注射小鼠，通過細胞融合、亞克隆篩選、擴增培養獲得2株分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，小鼠腹腔注射雜交瘤細胞后收集腹水，經Protein A柱純化獲得單克隆抗體。

本研究成功表達了高純度、高均一性的MAA蛋白以及高敏感性和特異性的單克隆抗體，MAA單克隆抗體的成功制備能夠有效促進基于單克隆抗體的診斷技術研發，例如免疫熒光法、免疫阻抗、膠體金免疫層析等。在后續的研究中將探索基于MAA蛋白及其單克隆抗體的奶牛乳腺炎檢測系統以期實現對奶牛乳腺炎及時準確地檢測。