禽致病性大腸桿菌clpV基因缺失株的構(gòu)建及其對(duì)Ⅰ型菌毛主要基因表達(dá)的影響

鐘昊然，王培莉，陳艷飛，孟 霞，朱國(guó)強(qiáng)，李建基，崔璐瑩，董俊升，王 亨*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)是我國(guó)禽大腸桿菌病的主要感染病原之一，至今尚無(wú)科學(xué)有效的防治措施[1]。APEC與新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli,NMEC)的毒力基因存在高度同源性，且已有APEC TW-XM菌株能引起禽腦膜炎的報(bào)道[2-3]。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，APEC已成為一種潛在的人獸共患病原菌，有使嬰兒感染新生兒腦膜炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)，具有重要的公共衛(wèi)生意義[4]。大腸桿菌作為革蘭陰性菌，可釋放一種多功能殺傷性武器T6SS(type Ⅵ secretion system,T6SS)，它能通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白作為武器攻擊靶細(xì)胞從而參與致病過(guò)程[5]。ClpV是一種拆解T6SS的元件，可允許細(xì)胞在ATP的驅(qū)動(dòng)下完成T6SS的回收和組裝[6]。研究證實(shí)ClpV在假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[7]的致病性方面有著重要作用，但ClpV在APEC腦膜炎的致病過(guò)程中發(fā)揮何種功能卻鮮有研究。

Ⅰ型菌毛是眾多革蘭陰性致病菌的表面附屬結(jié)構(gòu)，是主要的黏附因子，在細(xì)菌侵入機(jī)體的過(guò)程中扮演著重要角色[8-9]。已有研究表明，在E.coliK1所引起的新生兒腦膜炎中，Ⅰ型菌毛的黏附起決定性作用[10]。雖然T6SS與Ⅰ型菌毛均參與新生兒腦膜炎的致病過(guò)程，但兩者之間的聯(lián)系還有待進(jìn)一步詮釋。本研究利用Red同源重組系統(tǒng)，成功構(gòu)建了TW-XM菌株T6SS中的clpV基因缺失株與回補(bǔ)株，進(jìn)一步探究了clpV基因?qū)Β裥途铣傻挠绊懀瑸楹罄m(xù)研究APEC致腦膜炎的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒菌株APEC TW-XM、DH5α以及質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20均由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑、儀器氯化鈉、胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；氨芐青霉素、氯霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均購(gòu)自日本TaKaRa公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix、HiScript?兩步法RT-qPCR系列試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；MicroPulser Electroporator、CFX Connect熒光定量PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；NanoDrop 2000核酸測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank APEC TW-XM菌株(NO.KF678349.1)中已知的clpV基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增clpV基因的引物，命名為clpV-F/clpV-R，并且clpV-F/clpV-R可用于鑒定clpV基因缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建是否成功。此外，設(shè)計(jì)1對(duì)5′端與clpV基因兩翼同源(用下劃線標(biāo)出)，3′端與pKD3中間的氯霉素抗性基因cat兩側(cè)序列同源的重組引物，命名為ΔclpV-Cm-F/ΔclpV-Cm-R。回補(bǔ)引物pBR-clpV-F/pBR-clpV-R則根據(jù)無(wú)縫克隆技術(shù)設(shè)計(jì)[11]。所有引物均由南京擎科生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 構(gòu)建clpV基因缺失株與回補(bǔ)株的引物序列

1.4 一次同源重組菌的構(gòu)建與鑒定按照丁雪燕等[12]的方法，將clpV線性片段進(jìn)行擴(kuò)增、回收與純化。同時(shí)，將含有pKD46的TW-XM接種于含有L-阿拉伯糖(30 mmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中，使pKD46中的Exo、Bet及Gam蛋白充分表達(dá)，制備成感受態(tài)細(xì)胞。隨后將先前制備的clpV線性片段和TW-XM感受態(tài)細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以clpV-F/clpV-R為引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為Ex Taq DNA聚合酶12.5 μL，引物clpV-F/clpV-R各1.0 μL，模板1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至25.0 μL。PCR程序?yàn)?4℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。鑒定正確后由南京擎科生物技術(shù)公司測(cè)序，并命名為T(mén)W-XM△clpV::cat。

1.5 二次同源重組菌的構(gòu)建與鑒定將TW-XM△clpV::cat制備成感受態(tài)細(xì)胞，并將pCP20質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，隨后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含Amp和Cm雙抗性的LB平板上，篩選對(duì)Amp和Cm均敏感的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。以clpV-F/clpV-R為引物進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.4。鑒定正確后由南京擎科生物技術(shù)公司測(cè)序，并命名為T(mén)W-XM△clpV。

1.6clpV基因回補(bǔ)株的構(gòu)建與鑒定以pBR-clpV-F/pBR-clpV-R為引物，TW-XM為模板，PCR擴(kuò)增得到clpV基因，反應(yīng)體系為Q5 High Fidelity 2×Master Mix 25.0 μL、pBR-clpV-F/pBR-clpV-R各2.5 μL、模板1.0 μL、補(bǔ)ddH2O至50.0 μL。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后克隆至表達(dá)載體pBR322中，隨后將重組質(zhì)粒pBR322-clpV轉(zhuǎn)化至TW-XM△clpV，得到回補(bǔ)株TW-XMC△clpV，并經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.4。

1.7clpV基因缺失株與回補(bǔ)株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)將缺失株TW-XM△clpV與回補(bǔ)株TW-XMC△clpV在LB平板上連續(xù)傳代，取第1,10,20,30代的單菌落制備模板，進(jìn)行PCR鑒定以分析各菌株遺傳穩(wěn)定性，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同1.4。

1.8 細(xì)菌總RNA的提取挑取野生株TW-XM、缺失株TW-XM△clpV與回補(bǔ)株TW-XMC△clpV接種于LB液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)至D630為1時(shí)，用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA[13]。隨后采用NanoDrop 2000核酸測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，總RNA經(jīng)HiScript?兩步法RT-qPCR系列試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.9 熒光定量PCR檢測(cè)Ⅰ型菌毛主要基因的表達(dá)自NCBI GenBank 獲得大腸桿菌Ⅰ型菌毛主要基因(fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI)及內(nèi)參基因gapA的序列，設(shè)計(jì)引物交至南京擎科生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表2。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行熒光定量RT-qPCR。反應(yīng)體系為5 μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix，1 μL 正向引物，1 μL 反向引物，2 μL cDNA 模板，補(bǔ)去離子水至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 5 s；95℃ 50 s。數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量方法(2-△△Ct)。

表2 熒光定量PCR引物信息

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，*或#表示差異顯著(P<0.05)，**或##表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 融合PCR產(chǎn)物的鑒定如圖1所示，PCR擴(kuò)增出兩側(cè)與clpV基因上、下游序列同源、中間為cat基因的融合PCR產(chǎn)物，大小約為1 100 bp，與預(yù)期一致。表明擴(kuò)增出含clpV基因同源臂的cat基因序列。

M.DL2000 DNA Marker；1.融合PCR產(chǎn)物

2.2 同源重組菌的鑒定如圖2所示，PCR結(jié)果顯示：野生菌clpV擴(kuò)增片段約2 200 bp，TW-XM△clpV::cat重組體約1 800 bp，表明一次同源重組菌構(gòu)建成功。如圖3所示，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將pCP20導(dǎo)入TW-XM△clpV::cat，經(jīng)二次重組后篩選陽(yáng)性克隆，PCR鑒定顯示野生菌clpV擴(kuò)增片段約2 200 bp，重組體約為700 bp。表明二次同源重組菌構(gòu)建正確。進(jìn)一步對(duì)上述篩選的突變株clpV基因兩側(cè)序列克隆和序列測(cè)定。結(jié)果顯示經(jīng)二次重組后，突變株中的cat基因已完全消除，表明成功構(gòu)建clpV基因突變株TW-XM△clpV。

M.DL5000 DNA Marker；1.野生株clpV基因;2.含氯霉素抗性基因cat的clpV一次重組基因

M.DL5000 DNA Marker；1.野生株clpV基因;2.clpV基因二次重組后片段

2.3clpV基因回補(bǔ)株的鑒定如圖4所示，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示2個(gè)特異性條帶，其中700 bp左右條帶為clpV缺失株的二次同源重組條帶，2 200 bp左右條帶為回補(bǔ)質(zhì)粒pBR322-clpV中的clpV基因片段。測(cè)序驗(yàn)證顯示結(jié)果正確，表明回補(bǔ)株TW-XMC△clpV構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker；1.野生株clpV基因;2.clpV基因回補(bǔ)片段

2.4clpV基因缺失株與回補(bǔ)株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定如圖5所示，缺失株TW-XM△clpV與回補(bǔ)株TW-XMC△clpV經(jīng)連續(xù)傳30代后，對(duì)不同代數(shù)的缺失株與回補(bǔ)株分別進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示,不同代數(shù)的缺失株均可擴(kuò)增出二次同源重組的特異性條帶，而不同代數(shù)的回補(bǔ)株均可擴(kuò)增出二次同源重組的特異性條帶以及回補(bǔ)質(zhì)粒pBR322-clpV攜帶的clpV基因片段。各菌株均未發(fā)生突變，表明缺失株TW-XM△clpV與回補(bǔ)株TW-XMC△clpV具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

M.DL5000 DNA Marker;1.野生株clpV基因;2～5.缺失株TW-XM△clpV第1，10，20，30代中的二次重組片段;6～9.回補(bǔ)株TW-XMC△clpV第1，10，20，30代中的clpV基因回補(bǔ)片段

2.5clpV基因缺失對(duì)Ⅰ型菌毛主要基因mRNA表達(dá)的影響如圖6所示，缺失株TW-XM△clpV與野生株APEC TW-XM相比，fimA、fimB、fimC、fi-mD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。其中fimC、fimF、fimG、fimI的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；fimB、fimD、fimE的mRNA相對(duì)表達(dá)量則極顯著下降(P<0.01)；TW-XM△clpV組與APEC TW-XM組相比f(wàn)imA與fimH的mRNA相對(duì)表達(dá)量則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；回補(bǔ)株TW-XMC△clpV的各基因表達(dá)量得到了不同程度的恢復(fù)。

注：*或**表示與野生株APEC TW-XM相比，差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)

3 討論

基因敲除技術(shù)是一種將基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合的新型分子生物學(xué)技術(shù)。Red同源重組是通過(guò)自身RecA系統(tǒng)中的RecA和RecBCD蛋白，使2個(gè)DNA分子之間交換片段以達(dá)到序列敲除的目的。1998年，ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌屬中存在具有重組功能的RedE/RecT系統(tǒng)，而Red同源重組中的Exo和Beta蛋白也具有相同的功能。因此Red同源重組被認(rèn)為是適合大腸桿菌的一種基因敲除方法[15]。

2006年，PUKATZKI等[16]在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)了T6SS，此后對(duì)于T6SS結(jié)構(gòu)、功能機(jī)制的研究便不斷深入。現(xiàn)如今T6SS被認(rèn)為是許多革蘭陰性致病菌的潛在毒力決定因子，它能夠促進(jìn)細(xì)菌病原體之間，以及細(xì)菌病原體和宿主之間的相互作用，并在細(xì)菌將蛋白運(yùn)輸?shù)桨獾倪^(guò)程中發(fā)揮重要作用[17-18]。T6SS的核心組分之一ClpV是AAA+ATP超家族的成員，可允許細(xì)胞在ATP驅(qū)動(dòng)下完成T6SS組分的回收和組裝，并為T(mén)6SS分泌效應(yīng)蛋白提供能量[5]。

先前已有學(xué)者利用Red同源重組技術(shù)成功敲除了APEC CE129菌株中T6SS組分的hcp和APEC DE719菌株中T6SS組分的evfC基因，并對(duì)相應(yīng)的缺失株進(jìn)行生物學(xué)特性分析，結(jié)果顯示以上基因的缺失會(huì)對(duì)APEC的運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、黏附侵襲能力、胞內(nèi)存活能力以及對(duì)雛鴨的致病力產(chǎn)生影響[12，19-21]。證明T6SS參與了APEC的致病過(guò)程。TANG等[7]則利用RNA干擾技術(shù)使假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)中的clpV基因沉默，進(jìn)而在假單胞菌與大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)clpV基因的沉默可下調(diào)Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及細(xì)菌鞭毛合成相關(guān)基因的表達(dá)。證明clpV基因在假單胞菌的致病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)通過(guò)Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了APEC TW-XM菌株中T6SS的clpV基因缺失突變株，為后續(xù)研究clpV對(duì)APEC TW-XM的致病性影響奠定基礎(chǔ)。

Ⅰ型菌毛是大腸桿菌的重要毒力因子，它可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌黏附、侵襲到宿主黏膜表面、引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答等途徑增強(qiáng)細(xì)菌的致病力[9,23]。MA等[23]和FERNANDA等[9]在分別敲除了APEC TW-XM和APEC SEPT362中T6SS的hcp基因后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)和HeLa細(xì)胞的黏附能力均下降，從而導(dǎo)致菌株的致病力降低。以上研究證實(shí)T6SS與細(xì)菌的黏附存在一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

KISIELA等[24]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Ⅰ型菌毛的表達(dá)至少需要9個(gè)基因(fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI)。本試驗(yàn)在成功構(gòu)建clpV基因缺失株與回補(bǔ)株后，對(duì)以上9個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與野生株相比，在缺失clpV基因后，各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，其中fimC、fimF、fimG、fimI的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降；fimB、fimD、fimE的mRNA相對(duì)表達(dá)量則極顯著下降。說(shuō)明敲除T6SS核心組分的clpV基因會(huì)下調(diào)Ⅰ型菌毛的表達(dá)，進(jìn)而有可能對(duì)細(xì)菌的黏附侵襲能力產(chǎn)生影響。

本試驗(yàn)中clpV基因的成功敲除，有助于深入了解T6SS與Ⅰ型菌毛之間的作用機(jī)制，為研究APEC的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并有可能為禽大腸桿菌病疫苗的研發(fā)和防治提供新的靶標(biāo)。