豬鏈球菌腦膜炎小鼠模型的構建及特征性炎性細胞因子的檢測

吳 桐，孫瑩瑩，劉洪濤，雷連成

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是豬體內主要的共生菌之一，屬革蘭陽性菌，健康豬可攜帶該病原。王娟等[1]對廣州周邊地區健康豬群豬鏈球菌的攜帶情況調查發現，SS的陽性率達到33.81%。但在特定情況下，SS可轉為侵入病原，感染導致仔豬的腦膜炎、敗血癥、心內膜炎、關節炎和肺炎等[2-3]。豬鏈球菌病給世界養豬業帶來了巨大的經濟損失，據估計每年在美國可造成3億美元的損失[4]。雖然豬是SS的主要宿主，但研究證實SS還能夠感染其他的哺乳動物如牛等反芻動物，以及鳥類[5-6]。劉朋等[7]曾成功從表現化膿性肺炎及敗血癥病變的驢組織中，分離到SS血清2型株。此外，SS還是一種新興的人獸共患病原菌，主要感染與受感染的豬或豬肉制品密切接觸的特定職業人員[8]，在養豬戶、屠夫和屠宰場工人中經常引起腦膜炎并伴隨聽力降低的后遺癥，或出現敗血癥及其他疾病[2,9]。1998年和2005年我國2次暴發人感染豬鏈球菌事件,共有230人感染,52人死亡。2007年豬鏈球菌病曾在東南亞國家肆虐，目前,已成為越南、泰國致成人腦膜炎的第一大和第二大病原體[10]。至今，SS已經在世界范圍內造成了超過1 600例人感染病例[11]。SS是由多種不同分型構成的復雜群體，具有很強的異質性[12]，根據其莢膜抗原的不同，分為35個血清型(1～34和1/2型)，包含了700多種基因序列類型[4,13-14]。根據毒力的不同，這些不同血清型菌株被分為高致病性、低致病性(弱毒)及非致病性(無毒)株，一般認為，血清型2型SS(SS2)毒力最強，并且其臨床分離率最高[4]。李石等[15]對3種遼寧省流行的SS主要血清型(1，2和7型) 菌株進行小鼠腹腔和腦內接種的致病性試驗結果表明，SS2引起小鼠全部死亡，表現急性敗血癥以及嚴重腦膜炎，在三者中致病力最強。王治方等[16]通過對河南省不同規模豬場疑似SS病例進行分離，其中2型SS分離株占70%以上。

SS2引發腦膜炎的免疫學致病機制一直是防制該病的重要基礎問題。長期以來，為了復制SS2感染的典型癥狀，常使用仔豬作為對象建立感染模型，在仔豬模型上研究發現，腦膜炎型感染與非腦膜炎型感染在臨床癥狀、組織病變及細胞因子產生趨勢等方面有所差異，腦膜炎型感染引起腦、肺組織病變嚴重，而非腦膜炎型感染病變則主要在腎臟、脾臟和肺臟[17]。但因仔豬體型較大，養殖成本高，且單獨感染SS2不易成功[18,19]，常需與其他病毒共感染以改善感染效果；另外，還存在病理特征差異大、免疫細胞標志抗體種類少、試驗條件要求高等缺點，嚴重限制了對其機制的深入研究。近年來，以小鼠、豚鼠、兔等實驗室常用實驗動物為對象建立SS2感染模型的研究日益增多。小鼠感染SS2后，所有腦部區域以及腦膜均會發生病變[20]，針對SS2抗原進行免疫組化分析顯示，在病變部位均有陽性反應。此外，在體外試驗中使用SS2刺激小鼠小膠質細胞，可引起炎性細胞因子表達的增強，進一步證實了上述現象[20-21]。這些研究說明，以小鼠為研究對象構建SS2感染模型，復制SS2感染的典型癥狀是具有可行性的。但是尚無比較腦膜炎型與非腦膜炎型SS2感染小鼠的感染特征并綜合評價小鼠模型的報道。

本試驗使用腦膜炎型和非腦膜炎型SS2感染ICR小鼠，從臨床癥狀、免疫學指標、組織病理學變化、細菌定植部位等方面全面評價感染小鼠的感染特征，確證腦膜炎型和非腦膜炎型SS2小鼠感染模型的可行性，為體內免疫學機制的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物ICR 小鼠，6～8 周齡，體質量20～22 g，雌性，購自遼寧長生生物科技有限公司。

1.2 菌株腦膜炎型SS2株CVCC606、非腦膜炎型SS2株CVCC607，購自中國獸醫藥品監察所；編號為 JMS、WC/1、202、203 及 1B5 的菌株由哈爾濱獸醫研究所惠贈；編號為 90、92 及 95的菌株由南京農業大學惠贈。

1.3 主要試劑及試劑的配制瓊脂糖、瓊脂粉等購自北京鼎國生物試劑公司；胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)購自BD公司；小鼠IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17和MPO ELISA試劑盒購自上海勁馬科技有限公司。TSB 培養基：3% TSB粉末溶于ddH2O中，115℃，30 min高壓滅菌，使用時加入5%胎牛血清。TSA培養基：4% TSA粉末溶于ddH2O中，115℃，30 min高壓滅菌，使用時加入5%胎牛血清。無菌PBS緩沖液：NaCl 8.00 g， KCl 0.20 g， KH2PO40.27 g， Na2HPO4·12H2O 3.58 g，最后以ddH2O 1 000 mL溶解，使用5 mol/L NaOH溶液調節其pH值至7.2左右，121℃高壓滅菌30 min，高壓滅菌后4℃保存。10%多聚甲醛：稱取多聚甲醛粉末40 g 溶于 ddH2O 400 mL，60～70℃條件下加熱溶解，逐滴加入1 mol/L NaOH至溶液呈透明，冷卻備用。2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液：取10%多聚甲醛400 mL加入0.2 mol/L NaH2PO4-0.2 mol/L Na2HPO4混合液1 000 mL，再加入50%戊二醛溶液100 mL，最后定容至2 500 mL，保存備用。

1.4 SS2的培養與細菌計數按照本實驗室常用SS2培養計數方式進行[17]。

1.5 SS2感染小鼠試驗

1.5.1小鼠分組及感染 將 150只清潔級ICR小鼠均分為6組，每組25只。每組小鼠分別腹腔注射7×107CFU的不同SS2菌液，觀察并記錄臨床癥狀，具體分組方法如表1。

表1 小鼠分組及處理(n=25)

1.5.2細菌分離與PCR鑒定 將新鮮采集的小鼠血液進行合理稀釋并將稀釋液涂布TSA平板，在37℃條件下培養過夜(16～18 h)，待出現明顯單菌落后，挑取單菌落涂布于載玻片，加熱固定后利用革蘭染色快速試劑盒進行染色，并觀察細菌形態。挑取平板上的單菌落，接種于新鮮的TSB中，在37℃條件下，培養過夜(16～18 h)，吸取1 mL新鮮菌液，12 000 r/min離心5 min收集細菌，后續使用無菌PBS緩沖液重懸菌體，提取分離菌的全基因組，進行SS2 16S rDNA PCR 鑒定。引物序列如表2，PCR擴增體系見表3。PCR擴增程序:95℃預變性5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 60 s,共33個循環；72℃ 10 min。將PCR產物加入10×Loading Buffer混勻后，2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定16S rDNA擴增結果。

表2 SS2 16S rDNA PCR引物序列及產物長度

表3 SS2 16S rDNA PCR擴增體系

1.5.3血液指標的檢測 表1中第1組與第2組小鼠分別于感染后0，1，3，7，14 d 進行眼球采血，每組每次采血5只，900 μL外周血混合100 μL質量濃度為18 g/L的EDTA-2Ka溶液抗凝處理后取100 μL 進行PBS稀釋及細菌菌落計數；取500 μL剩余抗凝外周血進行血常規檢測，利用 MEK-7 222K 全細胞分析儀(Nihon Kohden，Japan)對收集的血液進行血常規檢測分析。第3組與第4組小鼠分別于感染后0，3，6，12，24 h進行眼球采血，每組每次采血5只，采得的外周血首先置于37℃培養箱 1 h，再斜面放置于4℃過夜，5 000 r/min離心3 min，取澄清上清即為血清，保存于-80℃條件下待用。將該血清樣品利用小鼠IL-6、IL-8、TNF-α和 IL-17 ELISA試劑盒檢測其中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-17的含量，步驟依照勁馬公司ELISA試劑盒使用說明書進行。第5組與第6組小鼠分別于感染后0，1，3，7，14 d 采集小鼠外周血，每次每組采血5只，如上處理后收集血清，利用小鼠IL-6 ELISA試劑盒檢測血清中IL-6的含量，步驟同樣按照勁馬公司ELISA試劑盒使用說明書進行。

1.5.4腦、腎臟及肺臟組織相關指標的檢測 表1中第1組與第2組小鼠分別于感染后1，3，7，14 d無菌剖取腦、腎臟及肺臟組織，每次每組采集5只。腦、腎臟組織加入無菌PBS研磨成勻漿，稀釋后進行細菌菌落計數；其中，取感染后3 d小鼠的部分腦、腎臟及肺臟組織制作組織切片，進行HE染色，方法依照常規病理切片制作方法進行[17]。第5組與第6組小鼠分別于感染后0，1，3，7，14 d處死，并解剖取出腦、脾臟、腎臟組織，每次每組采集5只。分別稱取100 mg的腦、腎組織，加入300 μL PBS研磨至勻漿樣，離心取上清后待測。利用小鼠MPO ELISA試劑盒檢測腦組織勻漿上清中的MPO含量，利用小鼠IL-6 ELISA試劑盒檢測腦、腎臟組織上清中IL-6的含量，ELISA試驗步驟嚴格按勁馬公司ELISA試劑盒說明書進行。取小鼠左半腦及全脾臟，測其質量后，腦組織在高溫烘箱中(≥80℃，≤100℃)烘干水分，約2 d后，水分去除完全再次測其質量，腦水含量=烘干前質量-烘干后質量。

1.6 統計學分析數據統計采用SPSS 19.0進行試驗數據分析，單因素方差分析用于各處理組間的差異性分析(*P<0.05，差異顯著； **P<0.01，差異極顯著)。

2 結果

2.1 臨床癥狀比較小鼠感染SS2后出現臨床癥狀的時間較早。在感染早期(約6 h)，各組小鼠即出現明顯的感染表現。非腦膜炎感染組小鼠表現出精神沉郁，進食減少，被毛立起能見頸背部皮膚，相互聚集不活動等；于腹腔注射后20 h，小鼠眼瞼被覆明顯膿性分泌物，導致小鼠雙眼睜開困難，此外無其他特征性癥狀。腦膜炎感染組小鼠除表現出以上精神沉郁，食欲不振等常見的感染癥狀外，于感染后24 h，在腦膜炎感染組中，觀察到部分小鼠出現典型神經癥狀，如脖頸向上彎曲，頭部頻頻顫動及間歇性轉圈等癥狀，此時對有神經癥狀的小鼠進行解剖觀察可見腦部有明顯的充血，說明小鼠已患有腦膜炎，模型構建成功。整體臨床癥狀上，兩組小鼠感染后均出現明顯感染癥狀，但腦膜炎感染組更加嚴重。

感染小鼠血液中均分離出SS2，通過PCR擴增16S rDNA對分離菌進行鑒定，結果顯示均能擴增出預期的片段(圖1)，同時，將分離菌送至上海生工生物工程公司進行測序，結果表明其16S rDNA與SS2 16S rDNA相吻合。結合上述臨床感染癥狀，說明SS2感染小鼠模型構建成功。

1.DL2000 DNA Marker；2～10.SS2 16S rDNA PCR產物；11.陰性對照

2.2 外周血血常規檢測血常規檢測小鼠感染SS2后血液中免疫細胞分布，結果發現，腦膜炎SS2(CVCC606)感染組小鼠的白細胞和中性粒細胞數量在感染后1 d均顯著高于非腦膜炎型SS2(CVCC607)感染組，而在感染后7 d，這種差異發生了倒轉(圖2)，推測在腦膜炎SS2感染組中，白細胞和中性粒細胞數在7 d下降的可能原因是由于細菌侵入腦組織，中性粒細胞隨之向腦部遷移，大量聚集的中性粒細胞進而促進了腦膜炎的發生。

注：*P<0.05；**P<0.01。下同

2.3 腦組織MPO含量檢測中性粒細胞在病原的刺激下發生聚集并釋放MPO，因此MPO的活性反映了組織中中性粒細胞浸潤的水平。本試驗對小鼠在SS2感染后1，3，7，14 d的腦組織中MPO活性進行測定，結果顯示，在感染后3 d，MPO活性在腦膜炎型SS2感染組中要顯著高于非腦膜炎型SS2感染組(圖3)，這表明腦膜炎型SS2感染小鼠，引起了中性粒細胞大量募集到小鼠腦組織中，促進了腦組織炎癥。

圖3 SS2感染對小鼠腦部MPO活性的影響

2.4 細菌定植分析在感染后的不同時間點，分別采取各組小鼠外周血，同時無菌解剖小鼠取出腦組織及腎臟，將血液及腦、腎組織勻漿合理稀釋后涂板統計單菌落數，計算血液及組織中定植的細菌數目(圖4)。從結果可見，血液中的最高定植量出現在感染后3 d，之后逐漸下降。且腦膜炎型SS2感染組與非腦膜炎型SS2感染組在外周血中的載菌量無明顯差異(P>0.05)(圖4A)。在腦組織中，相較于非腦膜炎型SS2感染，腦膜炎型SS2感染的定植量更高且差異顯著(圖4B)，而在腎臟組織中，得到了相反的趨勢，非腦膜炎型SS2感染組定植量顯著大于腦膜炎型SS2感染組(圖4C)。以上結果表明，SS2定植部位取決于感染菌株類型的不同，腦膜炎型SS2主要定植于腦部，而非腦膜炎型SS2則主要在腎臟。

圖4 SS2在血液(A)、腦(B)、腎臟(C)中的定植量

2.5 組織病理學觀察根據眼觀病理變化，腦膜炎型SS2感染組腎臟、肺臟組織發生炎癥變化，有明顯的充血表現，而非腦膜炎型SS2感染組的組織病理變化顯著嚴重于腦膜炎型SS2感染組(圖5)。且在感染后3 d，感染CVCC607小鼠脾臟增重極顯著高于感染CVCC606小鼠(圖6A)，而感染CVCC606小鼠腦水含量顯著高于感染CVCC607小鼠(圖6B)。對病理切片進行HE染色并進行病理組織學觀察發現，SS2感染的病理變化主要出現在腦、肺臟和腎臟組織，腦膜炎型SS2感染引起腦部出現膠質細胞結節(圖7B)、肺臟組織炎性細胞浸潤及淤血(圖7E)和腎臟組織淤血(圖7H)。而非腦膜炎型SS2感染的肺部、腎部的病理變化程度更加嚴重，然而在腦部未觀察到明顯的病理性病變。以上結果表明腦膜炎型與非腦膜炎型SS2感染導致的病變部位有所不同，腦膜炎型感染主要表現在小鼠腦部，而非腦膜炎型感染主要表現在小鼠的脾臟、腎臟及肺臟中。

A.CVCC606 感染組的肺臟；B.CVCC607 感染組的肺臟；C.CVCC606 感染組的腎臟；D.CVCC607 感染組的腎臟

圖6 小鼠脾臟增重(A)和腦水含量(B)檢測結果

圖7 小鼠腦、肺臟和腎臟組織病理學變化(HE染色，紅色箭頭指示病變部位)

2.6 外周血細胞因子的檢測外周血中炎性細胞因子的水平是指示炎癥水平的重要指標，在仔豬SS2感染模型中，炎性細胞因子在感染早期顯著升高，且腦膜炎型SS2感染引起更高水平炎性細胞因子的產生。在預試驗中，在小鼠SS2感染模型上也觀察到了類似的趨勢，除TNF-α外，其余3種細胞因子(IL-6、IL-8和IL-17)在腦膜炎型感染小鼠外周血中的含量顯著高于非腦膜炎型，TNF-α在2種SS2菌株感染組中差異不顯著(P>0.05)(圖8)。

圖8 血清中 TNF-α ELISA 檢測結果

為了確保模型的普遍性，本研究進一步選取5株SS2腦膜炎分離菌株(分別為JMS、WC/1、202、203及CVCC606)和5株非腦膜炎分離菌株(分別為90、92、95、1B5及CVCC607)分別感染小鼠，對感染后不同時間點外周血中細胞因子水平進行ELISA檢測，結果發現，兩類SS2菌株感染后血液中IL-6、IL-8和IL-17的水平在感染后均明顯升高，且兩組之間存在明顯差異(圖9)。IL-6在腦膜炎分離菌株感染組外周血中，顯著高于非腦膜炎分離菌株感染，且在感染后3，6，24 h差異極顯著，12 h 時差異顯著(圖9A)；IL-8在腦膜炎分離菌株感染組外周血中水平顯著高于非腦膜炎分離菌株感染組，在感染后12，24 h差異極顯著，其他時間點差異不顯著(圖9B)。IL-17與之類似(圖9C)。這些結果提示，炎性細胞因子的水平可作為區分腦膜炎型與非腦膜炎型SS2感染的早期診斷標志。

圖9 血清中IL-6(A)、IL-8(B)、IL-17(C) ELISA 檢測結果

2.7 IL-6在外周血、腦及腎臟組織中的分布在血清、腦及腎臟組織中，與PBS對照組相比，IL-6水平在SS2感染后極顯著升高。腦膜炎型SS2感染組在感染后1 d血清中IL-6分泌水平顯著高于非腦膜炎型SS2感染組，而在感染后7 d趨勢相反(圖10A)；腎臟組織IL-6分泌水平與之類似(圖10B)；而腦組織在感染后3 d開始，IL-6的分泌水平均為腦膜炎型SS2感染組極顯著高于非腦膜炎型SS2感染組(圖10C)。綜上推測，可能是由于中性粒細胞向腦中募集并提高了腦組織中IL-6的水平，或者細菌入腦的直接刺激引起了腦組織內上皮、內皮細胞等分泌的IL-6增加。

圖10 血清(A)、腎臟(B)、腦(C)組織中細胞因子IL-6含量的檢測結果

3 討論

SS2的感染可以干擾宿主對免疫反應的正常管制，一旦SS2在宿主體內定居并有效傳播，就會觸發促炎癥反應來對抗和殺死病原體，這種炎癥反應必須精確調節，以防止對宿主造成傷害。多種SS2的組分可以促進宿主炎癥的發生，引起以過度炎癥反應為特征的感染性休克，導致宿主在感染后數小時內死亡[22]。SS2的細胞壁成分能夠誘導腦微血管內皮細胞分泌IL-1、CXCL8和MCP-1[23]，進而增大血腦屏障滲透性，并通過引發腦膜炎幫助SS2向大腦移動。體外試驗證實，SS2可以引起血腦屏障(BBB)模型IFN-γ的顯著高表達，誘導豬腦微血管內皮細胞自噬，破壞BBB的完整性，增強屏障的通透性，從而促進細菌的穿越[24]。由SS2感染引起的人嚴重疾病的發病機制可以分為兩個階段，在第一個階段，血液中的SS2細胞壁成分經由模式識別受體，如TLR-2或/和CD14，與宿主的免疫系統互作；在第二個階段，這些宿主-病原體的相互作用觸發促炎細胞因子的暴發，導致中毒性休克的發生[25]。

在SS2感染的過程中，炎性因子IL-6、IL-8以及IL-17等，都發揮了重要的作用。在多種炎癥相關疾病中觀察到了IL-6的過量產生。IL-6能夠通過激活基質金屬蛋白酶9，介導對BBB與血腦脊液屏障(BCSFB)的破壞，這種作用導致屏障通透性升高，利于細菌和炎性細胞的侵入，促進了腦膜炎的發展。IL-8是重要的趨化因子，在多種細菌感染性疾病中表達量顯著升高，它主要將中性粒細胞募集到感染和損傷部位，同時還可以募集淋巴細胞，已經證實IL-8在增加血管通透性方面發揮重要作用，這種作用可能會導致蛛網膜下腔炎癥的發生。IL-17是連接T細胞激活與中性粒細胞動員、激活的關鍵細胞因子，IL-17可以介導病原體誘導的先天性免疫，促進炎癥性疾病的發生，如銀屑病和類風濕關節炎等。作為一種促炎細胞因子，IL-17可誘導間葉細胞和髓細胞釋放某些趨化因子、細胞因子、基質金屬蛋白酶和抗菌肽，這導致了先天免疫系統中中性粒細胞的擴增和積累，并在體內將先天免疫和適應性免疫聯系起來。越來越多的證據也表明，IL-17以及產生IL-17的細胞參與了各種疾病的發病機制，如過敏、自身免疫性疾病等[26-27]。研究發現，在多發性硬化病變中檢測到IL-17受體在BBB的內皮細胞上高表達，表明IL-17在體內和體外均參與了對BBB緊密連接的破壞[28]。IL-17與IL-6協同作用誘導星形膠質細胞表達IL-6，IL-6與IL-17之間又存在正反饋關系，反過來促進了IL-17的產生，導致炎癥反應加劇[29]。在本研究中，我們通過檢測小鼠血液中促炎細胞因子在SS2感染后的產生情況，發現腦膜炎型SS2感染后，這3種促炎因子的表達水平在24 h內顯著升高，且顯著高于非腦膜炎型SS2感染小鼠，提示炎癥細胞因子的水平可作為區別腦膜炎型SS2感染和非腦膜炎型SS2感染的早期診斷標志。在腦膜炎型SS2感染的仔豬模型上，12～24 h其IL-6、IL-8和IL-17的分泌均顯著高于非腦膜炎型SS2感染組，這種趨勢持續到感染后3 d左右，而在感染后5 d，腦膜炎型感染仔豬血液中細胞因子的含量會顯著降低，顯著低于非腦膜炎型感染組。小鼠在SS2感染后的細胞因子變化趨勢與仔豬基本符合，后續對小鼠體內IL-6水平的檢測也證實了這一點。

在細菌性腦膜炎病程中，過高水平的促炎細胞因子和趨化因子與腦膜炎的發生相關， 已經證實IL-6、IL-8水平在腦膜炎患者腦脊液中顯著升高[30-31]。在本試驗中，我們通過對比不同類型SS2感染小鼠后的病理變化及細胞因子變化趨勢，證實IL-6的表達與腦膜炎的進程相關，表明腦組織是腦膜炎型SS2感染的主要靶器官，而非腦膜炎型SS2感染則主要定植于脾、腎臟及肺臟組織，引起組織病變，這與在仔豬模型上觀察到的基本相同。感染后24 h，部分腦膜炎型CVCC606株感染組小鼠出現抽搐、頭頸向上彎曲及間歇性轉圈運動的神經癥狀。腦膜炎在豬模型上的表現為抽搐、劃水樣神經癥狀；在豚鼠表現為抽搐及角弓反張[32-33]；小鼠表現出與仔豬類似的神經癥狀，說明腦膜炎模型構建成功。而在非腦膜炎型CVCC607株感染組，未觀察到明顯的神經癥狀。小鼠體內SS2的定植時間也與仔豬模型具有十分相似的趨勢，說明二者特異性免疫的效應時間可能類似。免疫細胞的分布也能夠反映炎癥的進程，通過對血液中免疫細胞數量進行分析發現，SS2感染造成了免疫細胞數快速升高，提示炎癥反應的快速發展，且腦膜炎型SS2感染組免疫細胞數在7 d內均顯著高于非腦膜炎型SS2感染組，這種趨勢在感染后7 d發生倒轉，提示腦膜炎型SS2感染導致腦膜炎的進程中，中性粒細胞向腦部發生聚集。這種細胞水平的變化在小鼠模型上要明顯快于仔豬模型，仔豬模型往往在感染后2～3 d才開始體現出這種顯著性差異水平。對IL-6及MPO的檢測表明，相比于非腦膜炎型SS2感染，腦膜炎型SS2感染組腦組織中中性粒細胞發生大量浸潤，同時，腦組織中IL-6與感染早期血液中的IL-6水平，也均顯著高于非腦膜炎型SS2感染組，結合我們對小鼠體內SS2定植量的檢測，發現二者存在著正相關性，這種相關性提示IL-6在一定程度上可反映腦膜炎型SS2感染的進程。

通過以上試驗，提示ICR小鼠可以作為很好的仔豬替代模型動物，無論在組織病變類型、部位或者細胞因子的產生及變化趨勢，以及白細胞、中性粒細胞動力學變化等方面都具有很高的相似性。甚至在某些方面，如感染后出現癥狀的時間，細胞因子變化的時間等方面，小鼠更加迅速且明顯，優于仔豬模型，便于在試驗過程中短期得出結果。但在其他一些方面，如對腦脊液的獲得，臨床癥狀如腦膜炎的典型程度等，仔豬仍然是較好的選擇。已有研究中證實，經ICR小鼠消化道或皮膚創面感染SS2的效果優于腹腔注射，得到了更高的病死率[34]，如果針對存活率進行檢測，需要考慮到感染方式不同所帶來的差異，因此本次試驗中，采用了腹腔注射的感染方式。不同品系小鼠對SS2的敏感性也有所不同，本試驗中采用ICR小鼠進行試驗，表現出了與仔豬類似的病理變化，重復性較好，但有研究采用BALB/c小鼠構建感染模型發現SS2的致病力對小鼠和豬存在差異[35]。雖然有研究者認為小鼠不適合作為SS2感染的腦膜炎動物模型[36]，但我們的結果表明，選取特定小鼠品系進行試驗，可以在一定程度上代替豬作為模型進行研究。除小鼠外，豚鼠、斑馬魚等也已經證實可以作為SS2感染模型進行試驗[32,37]，這些實驗動物作為豬的替代動物，各有優劣，需要根據實驗動物的不同，采取相應的感染方式，并根據感染后的臨床表現，制定適合的研究內容。

總之，在本研究中，我們通過一系列小鼠感染試驗，首次證實了SS2感染引起的小鼠炎性細胞因子的表達受菌株類型影響，腦膜炎型SS2感染引起的炎性細胞因子水平顯著高于非腦膜炎型SS2感染，包括IL-6、IL-8及IL-17；同時還發現，SS2感染后IL-6的水平升高與腦膜炎的發展呈正相關，通過檢測IL-6的水平可以在一定程度上反映腦膜炎感染的進程，這為進一步研究豬鏈球菌性腦膜炎的診斷、致病性和免疫致病機理奠定基礎。我們的結果還說明，ICR小鼠可以用于SS2引起的腦膜炎相關研究，是仔豬良好的替代模型動物，IL-6在小鼠外周血和腦組織中的表達具有一致性，可作為小鼠成功感染的評價指標。