感染乙腦病毒小鼠腦組織的轉錄組變化分析

高明星，張金花，劉澤霖，周靜靜，胡薛英，張萬坡，程國富，谷長勤

(華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢 430070)

日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是由庫蚊傳播的黃病毒屬的正鏈單鏈RNA病毒。JEV是一種神經入侵性病毒，會導致血腦屏障通透性發生改變[1]。JEV進入中樞神經系統后，在腦內復制和增殖，引起許多動物的腦炎和神經系統疾病，嚴重威脅人類和其他動物的生命安全[2]。在臨床腦炎病例中，有20%～30%的病例是致命的，有30%～50%的恢復病例會有嚴重的神經系統癥狀[3]。雖然有商品化的疫苗，但JEV仍是亞洲病毒性腦炎的主要原因[4]，可能與各國免疫制度有關。

RNA-Seq技術，又被稱為轉錄組測序技術，已成為研究動物病毒傳染病與宿主相互作用的重要技術之一[5]。探索JEV的致病機理，可以為更好的預防和治愈乙型腦炎提供科學依據。已有研究用轉錄組技術分析JEV感染巨噬細胞、敲除RIPK3基因小鼠和人神經母細胞瘤細胞后細胞因子和通路的變化[6-8]。然而至今很少有體內乙腦病毒感染在基因轉錄水平上較全面的調控機制分析。

本研究以105PFU的P3株乙腦病毒感染6周齡BALB/c雌鼠，感染6 d后分別取對照組和感染組腦組織，進行轉錄組分析，分析體內參與抗病毒過程的相關基因和途徑，為乙腦的發病機制及防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗動物乙型腦炎病毒P3株由華中農業大學微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈。病毒采取乳鼠腦內擴增，空斑試驗測定病毒毒價。6周齡BALB/c雌鼠購自華中農業大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑和儀器JEV E蛋白單克隆抗體，由華中農業大學農業微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈；HRP標記的羊抗鼠/兔IgG購于基因科技有限公司；固體DAB購于武漢博士德生物公司；TRIzol購自南京諾維贊有限公司；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購于TaKaRa公司。Nikon 80i生物光學顯微鏡購于日本Nikon公司；熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.3 試驗設計及采樣將30只6周齡BALB/c雌鼠隨機分為2組，感染組(20只)腹腔注射105PFU JEV P3毒株0.5 mL，對照組(10只)腹腔注射同體積的DMEM。注射后5 d小鼠出現典型的神經癥狀。注射后6 d對照組小鼠隨機處死9只，感染組選取神經癥狀明顯的9只小鼠剖殺。隨機3只小鼠腦組織混為1個樣本，每組3個樣本，共6個樣本。剩余小鼠處死。對照組樣本編號為CK-1、CK-2和CK-3，感染組樣本編號為T1-1、T1-2和T1-3，送廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序。剩余的腦組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，用于組織學觀察。

1.4 組織病理學觀察和病毒抗原定位分析將上述固定完全的組織經脫水、透明、浸蠟、包埋后制作石蠟切片，切片厚度4～5 μm，HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠腦組織的組織病理學變化。

抗原定位采用免疫組化(IHC)的方法，具體步驟簡述如下：石蠟切片脫蠟至水；3%過氧化氫處理30 min，0.01 mol/L PBS洗滌2次；將玻片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，蒸汽熱修復，于95～100℃保持30 min，取出自然冷卻；PBS洗滌后，5%BSA封閉30 min，滴加JEV E 蛋白單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜；PBS洗滌后滴加HRP標記的二抗室溫作用30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹膠封片。利用光學顯微鏡與圖像采集系統觀察并采集圖像。

1.5 轉錄組分析

1.5.1腦組織RNA提取 采用TRIzol法對腦組織樣品進行RNA的提取，經檢測確定合格后得到轉錄組測序使用的總RNA。

1.5.2cDNA文庫構建及測序 樣品提取總RNA后，對于真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation Buffer使其成為短片段，再以短片段的mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第2鏈。經過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經末端修復、加堿基A及測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeqTM進行測序。

1.5.3差異基因的篩選 使用edgeR軟件對樣本間基因表達量進行差異分析，利用FDR與log2(FC)來篩選差異基因，篩選條件為FDR<0.01且|log2FC|>1。

1.5.4DEGs GO與KEGG注釋及富集分析 根據GO和KEGG注釋結果以及官方分類，對篩選出的差異基因(DEG)與GO數據庫中的分子功能(MF)、細胞組分(CC)、生物學過程(BP)以及KEGG Pathway數據庫進行注釋，同時進行富集GO條目篩選和Pathway顯著性篩選。

1.5.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證 根據1.5.4分析結果，選擇8個與JEV進入機體和復制有關的差異基因，進行RT-qPCR定量驗證。其中與免疫相關的Trim25顯著上調，Hes5、P2ry12、Bpifa1和Cd4顯著下調；與炎癥相關的基因TNF-α、SOCS1和SOCS3顯著上調。反應的引物序列如表1。應用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進行Q-PCR反應。擴增條件：預變性95℃ 30 s；進入循環，95℃ 5 s，56℃ 30 s，共40個循環；溶解曲線分析，95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。計算出的Ct采用2-ΔΔCt法計算基因的mRNA轉錄水平。

表1 差異基因 Q-PCR引物序列

2 結果

2.1 JEV感染小鼠的腦組織病理變化及病毒抗原的定位鏡下觀察腦組織，對照組小鼠腦組織無明顯病理變化(圖1A)，而JEV感染后小鼠腦內發現單核樣細胞大量浸潤、神經元變性壞死，小膠質細胞增生明顯，同時腦內血管周炎性細胞滲出明顯(圖1B)，部分區域可形成明顯的管套現象。

IHC結果顯示：對照組小鼠腦組織切片背景清晰(圖1C)，JEV抗原的陽性信號呈棕黃色，主要定位在神經元的胞質。感染組小鼠腦組織的不同區域內均可見大量的抗原陽性的細胞(圖1D)。

A.對照組小鼠腦組織，HE；B.JEV組小鼠腦組織血管周淋巴細胞浸潤，HE;C.對照組小鼠腦組織，IHC；D.JEV組小鼠腦組織(棕黃色指示細胞質中的JEV抗原)，IHC

2.2 測序數據及質量情況使用Illumina HiSeqTM平臺一共測了6個樣本，下機后對經過初步過濾得到的Clean Reads進行進一步更嚴格的過濾，得到High Quality Clean Reads，比對到物種的參考基因組上，Clean Reads Q30(%)都在95%以上，滿足Q30標準；不確定堿基(N)比例均小于0.01%(表2)；從測序結果分析可以看出數據質量較高，可用于后續分析。

表2 轉錄組測序數據產出情況匯總表

2.3 差異基因的篩選以FDR<0.01且|log2FC|>1，作為篩選標準，篩選對照組(CK組)與感染組(T1組)之間的差異表達基因，差異表達基因有1 940 個，其中有1 813個基因上調表達，127個基因下調表達(圖2)，大部分都與炎癥、免疫、防御反應相關。對T1組參與免疫系統過程的相關差異基因進行功能注釋見表3。

表3 免疫相關差異基因

圖2 差異表達基因數量統計表

2.4 差異基因的GO分析將T1篩選到的差異基因進行GO聚類功能分析，總共涉及41種生物功能(圖3)。T1組生物學過程中涉及到細胞過程、單一生物過程、對刺激的反應注釋量較多。涉及免疫系統過程的有651個差異基因，其中637個上調表達，14個下調表達。并且免疫系統過程是最顯著富集的GO Term(圖4)。在細胞組分中細胞、細胞部分、細胞器注釋量較多；在分子功能中結合、催化活性注釋量較多。

圖3 差異基因GO注釋

圖4 BP中顯著性柱狀圖

2.5 差異基因的KEGG分析T1組共篩選到820個差異基因，富集到KEGG數據庫中，被注釋到具體的代謝通路268條。篩選出差異基因顯著性富集最多的前幾條代謝通路(圖5)，分別是細胞因子與細胞因子受體的相互作用(Ko04060)、單純皰疹感染(Ko05168)、TNF信號通路(Ko04668)、NF-κB信號通路(Ko04064)、破骨細胞分化(Ko04380)。Pathway數目統計圖可以展示基因在KEGG Pathway中的基因數量，參與到免疫系統這個通路的差異基因有302個，是參與基因數量最多的(圖6)。

圖5 差異基因KEGG Pathway富集氣泡圖

圖6 Pathway數量統計圖

2.6 熒光定量RT-PCR驗證qPCR驗證結果顯示：Trim25、Hes5、P2ry12、Bpifa1、Cd4、TNF-α、SOCS1和SOCS3這8個基因的差異倍數與RNA-Seq結果表達趨勢基本一致(圖7)。

差異基因

3 討論

目前對大部分黃病毒致病機理的研究都建立了小鼠疾病模型。本試驗接毒后5～6 d的發病小鼠呈現典型的神經癥狀，部分小鼠出現立毛、弓背及運動功能障礙的表型癥狀。JEV感染小鼠后5～10 d，張金花等[9]病理學觀察發現大腦灰質神經元變形壞死，膠質細胞增生及血管周圍炎性細胞聚集等顯著的炎性反應。這與本研究組織病理學結果一致。結合大部分神經元細胞JEV抗原陽性反應，證明成功建立了小鼠的乙腦模型。

本試驗對JEV感染小鼠腦組織進行高通量測序分析，共篩選到1 913個差異表達基因，大都與炎癥、免疫反應相關。GO功能富集分析中，免疫系統過程是最顯著富集的GO Term。JEV感染人神經上皮瘤細胞的轉錄組也證實了許多與免疫有關的基因發生變化，差異基因主要涉及抗微生物反應、細胞信號傳導、細胞功能和維持等[10]。JEV感染人神經母細胞瘤細胞差異基因轉錄本的GO term分析發現2個主要功能的mRNA顯著富集：內質網核信號和內質網的未折疊反應。并且內質網中的蛋白質加工是最顯著富集的生物學通路[8]。前幾個顯著富集功能不同可能由于本研究中使用的小鼠和人源細胞之間的物種差異導致。

在KEGG富集分析中，參與到免疫系統的差異基因數目最多，富集的通路直接或間接都與抗病毒反應有關，分別是細胞因子-細胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和TNF信號通路。JAKs激活后磷酸化受體及胞內轉錄因子STAT及STAT蛋白轉運到細胞核中，激活一系列細胞因子的轉錄[11]。內質網應激反應的相互作用網絡的一部分包含組成免疫信號通路的部分，比如STAT、JNK和NF-κB。本研究中JEV感染導致小鼠內質網應激蛋白PERK、ATF4、CHOP的表達增加，WANG等[12]研究表明體內和體外JEV感染可以通過二聚化激活PERK，并通過PERK-ATF4-CHOP途徑導致細胞凋亡。CARR等[8]研究發現JEV感染后抗氧化劑Sestrin 2上調，并且內質網應激途徑轉錄本顯著上調。這與以上的研究結果一致。表明JEV在體內與體外神經元細胞內復制，刺激機體發出趨化信號，進而激活適應性免疫反應，從而引起機體基因變化，整個過程是一個多基因參與表達且調控的復雜網絡系統。同時，視黃酸誘導型基因1樣受體(RIG-1)、Toll樣受體3(TLR3)等模式識別受體可以識別病毒成分，經過一系列信號轉導激活AP-1和NF-κB介導的炎癥反應，誘導各種ISGs的表達，防止病毒入侵[13]。這與JE的神經病理學一致，其特征是嚴重的神經炎癥和以巨噬細胞和活化T細胞為主的炎性細胞浸潤[14]。

本研究中SOCS1和SOCS3轉錄本均顯著上調，并且共同在JAK-STAT信號通路中發揮關鍵作用。KUNDU等[15]研究發現隨著感染時間延長，JEV會上調細胞因子信號傳導抑制劑SOCS1和SOCS3的表達，改變JAK-STAT信號傳導級聯，抑制炎性細胞趨化因子的釋放，從而破壞宿主的先天性免疫反應，有助于病毒的復制。另外YE等[16]證明JEV NS5蛋白通過與核轉運蛋白KPNA2、KPNA3和KPNA4相互作用，抑制干擾素調節因子3(IRF3)和NF-κB的表達。JEV感染也誘導RIPK3的表達，抑制IFI44L等ISGs的表達[7]，這表明JEV會通過某種機制阻止細胞信號傳導，抑制I型干擾素(IFN)反應和抗病毒反應，逃避宿主先天免疫反應。

在JEV感染過程中，宿主的先天性免疫應答對于限制病毒復制和清除宿主體內的病毒是非常重要的。本研究中，采用RNA-Seq得到JEV感染小鼠后腦組織的詳細轉錄組學，系統性分析了JEV感染機體后免疫相關基因參與的代謝途徑與信號轉導途徑，為研究機體的抗病毒反應提供了理論依據。