弓形蟲SAG1重組抗體制備及抗原表位鑒定

莊浩瀚，潘靈韜，姚晨倩，陳學秋，陽毅敏，趙明秀，林 蜜，楊 怡，杜愛芳

(浙江大學 動物科學學院 浙江大學動物預防醫學研究所 浙江省動物預防醫學重點實驗室,浙江 杭州 310058)

弓形蟲是一種專性寄生于宿主的單細胞寄生蟲。其可以感染包括人類在內的幾乎所有溫血動物，是典型的人畜共患寄生蟲[1]。人和動物通過食用未煮熟的食物或者被弓形蟲卵囊污染的水而被弓形蟲感染。據2019年的報道估計，全世界動物的弓形蟲血清陽性率約為25%[2]。弓形蟲也是一種機會性致病寄生蟲，在免疫力低下的人群中，如(人免疫缺陷病毒HIV)感染者，接受腫瘤化療的患者，臟器移植患者等，弓形蟲感染會直接致死。而且，弓形蟲還能通過母嬰傳播，導致流產、死胎或者新生兒畸形[3]?；前粪奏ず鸵亦奏な悄壳爸委煿蜗x病的藥物，但只能抑制弓形蟲增殖，并不能徹底根除弓形蟲[4]。商業化的疫苗暫時只有1個Toxovax，然而僅限于綿羊養殖預防[5]。

弓形蟲生物學功能研究是弓形蟲病預防治療的基礎。免疫印跡和免疫熒光等試驗是研究弓形蟲蛋白功能所必須的，這些試驗高度依賴于特異有效的抗體。市場化的抗體絕大部分都是針對人源蛋白設計的，無法保證適用于弓形蟲蛋白的研究。因此，制備弓形蟲蛋白特異性抗體對科學研究來說是不可或缺的。多克隆抗體和單克隆雜交瘤抗體技術已經被廣泛運用于抗體制備，然而多克隆抗體，有可能缺乏批次間的可重復性，而單克隆雜交瘤細胞培養過程有污染或者基因突變的可能，導致抗體分泌失效。重組抗體由真核細胞表達已知序列信息的抗體重鏈和輕鏈而形成，可以避免多克隆抗體的批次不穩定性和雜交瘤單克隆抗體失效的問題，從而被科研工作者所青睞[6]。目前，弓形蟲蛋白抗體大多是多克隆或雜交瘤單克隆抗體，而重組抗體比較少見。本研究利用單個質粒表達抗體重鏈和輕鏈，制備了弓形蟲SAG1重組抗體，試驗結果表明該重組抗體特異性高、批次間可重復性強，而且可重新編輯加入熒光基團，適用于免疫印跡和免疫熒光試驗。本研究采用的重組抗體制備方法可為其他蛋白的抗體制備提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 蟲株、細胞株、感受態細胞及質粒弓形蟲RH蟲株、Vero細胞、HEK293T細胞、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0、TOP10感受態細胞、BL21感受態細胞、pET-32a和pCMV-EGFP表達載體為本實驗室保存;重組抗體表達質粒購于Addgene(ID：28217)。

1.2 RNA提取、逆轉錄試驗、凝膠回收和質粒提取弓形蟲以及雜交瘤的RNA提取采用Thermo公司TRIzol(15596018)通用提取方法，逆轉錄過程使用TOYOBO公司逆轉錄試劑盒ReverTra Ace(FSK-101)。凝膠回收和質粒提取使用杭州尚亞生物公司試劑盒(DR0101250/DR0201250)。具體操作詳見試劑和試劑盒說明書。

1.3 SAG1重組蛋白表達純化及小鼠免疫PCR克隆弓形蟲SAG1蛋白序列(45～198 aa)，引物詳見表1(酶切位點和保護堿基以下劃線標注)。將PCR產物和pET-32a質粒用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切(TaKaRa，D1040/D1060)，切膠回收后通過T4連接酶連接(TaKaRa，D2011)，轉化BL21感受態細胞后，挑取陽性克隆測序驗證連接成功。用Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)(生工生物，A100487)誘導陽性克隆表達重組蛋白，隨后用鎳柱純化蛋白(常州天地人和，SA005)，并用BCA試劑盒(杭州弗德生物，FD2001)進行蛋白定量。小鼠免疫過程依照本實驗室優化的方法進行[7]。

1.4 雜交瘤融合和篩選免疫后的小鼠于眼眶采血收集少量血液，37℃放置1 h后，4℃、3 000×g離心10 min，收集血清。以SAG1重組蛋白為抗原，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)和免疫印跡試驗驗證血清中抗體的特異性。隨后脫頸處死免疫小鼠，獲取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，融合篩選過程參考文獻所述[8]。

1.5 克隆雜交瘤的重鏈和輕鏈PCR克隆雜交瘤的重鏈和輕鏈，引物為文獻[9]所用兼并引物。抗體的重鏈和輕鏈的恒定區序列已經存在于重組抗體表達質粒，試驗過程中，將抗體的重鏈和輕鏈的可變區克隆到重組抗體表達質粒， 酶切體系使用AscⅠ和NotⅠ限制性內切酶(NEB，R0558/R3189)。構建過程如圖4A所示，具體過程詳見參考文獻[9]。

1.6 重組抗體表達和驗證將重組抗體表達質粒轉化TOP10感受態細胞，菌落PCR驗證陽性克隆，將陽性克隆擴大培養，抽提質粒。隨后，利用Thermo公司的Lipofectamin 2000轉染試劑(116-68019)將質粒轉染HEK293T細胞，轉染24 h后，收集細胞上清，以弓形蟲的全蟲蛋白為抗原進行免疫印跡試驗，同時固定弓形蟲細胞，進行免疫熒光試驗驗證重組抗體的特異性。

1.7 重組抗體抗原表位鑒定利用pET-32a和pCMV-EGFP質粒，構建SAG1重組蛋白表達質粒，其中32A-SAG1為重組蛋白的原核表達體系，EGFP-SAG1為EGFP在C端融合SAG1短肽的真核表達體系。引物詳見表1(酶切位點和保護堿基以下劃線標注)。將32A-SAG1表達質粒轉化BL21感受態細胞，并用IPTG誘導蛋白表達，同時將EGFP-SAG1表達質粒用Lipofectamin 2000轉染試劑轉染HEK293T細胞，質粒轉染細胞24 h后收集細胞樣品裂解備用，以32A-SAG1表達菌和EGFP-SAG1重組蛋白表達細胞為蛋白樣品，以轉染重組抗體質粒的HEK293T細胞培養上清為一抗進行免疫印跡試驗。質粒構建引物詳見表1。

表1 引物序列信息

2 結果

2.1 SAG1(45～198 aa)重組蛋白原核表達質粒構建以弓形蟲的cDNA為模板，通過PCR克隆弓形蟲的SAG1蛋白的基因片段序列，獲得PCR產物，將PCR產物和pET-32a質粒進行酶切，獲得PCR酶切產物約500 bp(圖1A)和質粒酶切產物約5 000 bp(圖1B)，將2個產物用T4連接酶在16℃連接4 h，隨后轉化BL21感受態細胞，涂布于氨芐LB培養板，在37℃培養箱培養過夜。

A.SAG1蛋白(45～198 aa)基因片段PCR酶切產物凝膠電泳結果(M.DL100 DNA Marker,1.SAG1(45～198 aa)PCR酶切產物)；B.pET-32a質粒酶切產物凝膠電泳結果(M.DL5000 DNA Marker,2.pET-32a質粒酶切產物)

2.2 SAG1(45～198 aa)重組蛋白誘導表達挑取氨芐LB培養板上的克隆，由杭州尚亞生物公司測序驗證插入序列。隨后將陽性克隆在LB液體培養基中培養到D值約為0.6，加入0.5 mmol/L IPTG培養6 h，誘導蛋白表達。誘導好的大腸桿菌4℃、12 000×g離心10 min，用含10 mmol/L 咪唑的 PBS溶液重懸沉淀后，超聲裂解30 min，將裂解產物4℃、12 000×g離心10 min，上清用0.22 μm過濾器過濾后，加入鎳柱，4℃孵育2 h后，分別用10，50，100，200，400 mmol/L 咪唑進行洗脫。SDS-PAGE結果顯示得到純化后的蛋白(圖2)。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的蛋白，按每只小鼠20 μg重組蛋白的劑量免疫BALB/c小鼠。

M.蛋白質相對分子質量Marker；1.10 mmol/L咪唑；2～4.50 mmol/L咪唑；5～7.100 mmol/L咪唑；8～10.200 mmol/L咪唑；11～14.400 mmol/L咪唑

2.3 SAG1雜交瘤構建將免疫好的BALB/c小鼠進行眼眶采血，用免疫印跡驗證血清可以識別SAG1(45～198 aa)重組蛋白后，對小鼠進行脫頸處死，取脾臟在200目細胞篩上研磨獲取脾臟細胞，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，用有限稀釋法將融合的細胞培養在96孔板里，在含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培養基(HAT)中進行選擇性培養。1周后取培養上清進行ELISA和免疫印跡試驗。結果顯示克隆1C7可以在ELISA試驗(圖3A)和免疫印跡試驗(圖3B)中識別SAG1(45～198 aa)重組蛋白。將克隆1C7雜交瘤擴大培養進行后續試驗。

A.雜交瘤克隆ELISA試驗結果；B.雜交瘤克隆1C7培養上清免疫印跡結果； M.蛋白質相對分子質量 Marker；1.克隆1C7培養上清免疫印跡

2.4 SAG1重組抗體表達質粒構建將1C7克隆雜交瘤進行RNA提取和逆轉錄試驗，用兼并引物將抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區克隆到重組抗體表達質粒28217，質粒構建策略如圖4A所示，試驗對28217質粒進行了改造，在重鏈恒定區的C端加入mCherry片段，方便后續的細胞轉染試驗。重鏈可變區、輕鏈可變區、linker片段以及融合片段的PCR產物如圖4B所示，將融合片段PCR產物和改造的28217質粒用AscⅠ和NotⅠ進行雙酶切，用T4連接酶連接，轉化TOP10感受態細胞，涂布于氨芐LB培養板上培養。由于雜交瘤自身攜帶1條異常輕鏈序列，我們用菌落PCR將大腸桿菌克隆進行區分，正常輕鏈引物能在全部克隆中擴增到500 bp左右的PCR產物(圖4C),異常輕鏈引物能在部分克隆中擴增到500 bp左右的PCR產物(圖4D)，將異常輕鏈引物可擴增到條帶的克隆被排除，無擴增條帶的克隆被保存，擴大培養，提取質粒。

A.質粒構建策略圖；B.重鏈可變區、輕鏈可變區、linker片段以及融合片段的PCR產物凝膠電泳結果(M.DL5000 DNA Marker,1.重鏈可變區PCR產物,2.輕鏈可變區PCR產物,3.linker片段PCR產物,4.1～3融合片段PCR產物)；C.正常輕鏈PCR產物凝膠電泳結果(M1.DL100 DNA Marker,5～28.菌落PCR由正常輕鏈可變區引物擴增的PCR產物)；D.異常輕鏈PCR產物凝膠電泳結果(29～52.菌落PCR由異常輕鏈可變區引物擴增的PCR產物)

2.5 SAG1重組抗體驗證陽性克隆質粒抽提后，以1 μg質粒加上3 μL轉染試劑的比例轉染HEK293T細胞，由于重組抗體表達質粒帶有mCherry基團，轉染效率可以通過熒光顯微鏡直接觀察(圖5A)。我們隨機選擇了7個陽性克隆的重組抗體表達質粒進行細胞轉染，轉染24 h后，收取細胞培養上清，以弓形蟲全蟲蛋白做免疫印跡試驗，結果顯示7個克隆中，有6個克隆能夠識別約為35 kDa 大小的蛋白(圖5B)。同時，免疫熒光試驗顯示，通過甲醇固定后，重組抗體定位在弓形蟲細胞外圍，符合SAG1的定位情況(圖5C)。由于重組抗體重鏈C端連有mCherry基團可以直接發出熒光，試驗過程并不需要熒光二抗的參與。

A.重組抗體質粒轉染HEK293T細胞免疫熒光結果；B.轉染重組抗體質粒HEK293T細胞培養上清免疫印跡結果(M.蛋白質相對分子質量Marker,1～7.7個重組抗體質?？寺〉拿庖哂≯E結果);C.轉染重組抗體質粒HEK293T細胞培養上清的弓形蟲免疫熒光結果

2.6 重組抗體抗原表位鑒定利用pET-32a和pCMV-EGFP質粒，構建SAG1重組蛋白表達質粒，首先，將重組蛋白45～198 aa分為3個片段構建到pET-32a質粒進行表達(圖6A)，結果顯示只有45～98 aa能夠被重組抗體識別；其次，將45～98 aa 再分為3個片段構建到pCMV-EGFP質粒進行表達(圖6B)，結果顯示只有81～98 aa能夠被識別；再次，將81～98 aa分為15個片段構建到pCMV-EGFP質粒進行表達(圖6C)，明確重組抗體識別抗原N和C端位置分別為84和90 aa； 最后通過抗原N和C端各縮短1個氨基酸(圖6D)，確認重組抗體的抗原表位為SAG1(84～90 aa)的7個氨基酸。

A.重組蛋白(45～198 aa)[1～3.32a-SAG1(45～98 aa)、32a-SAG1(99～144 aa)、32a-SAG1(145～198 aa)]；B.重組蛋白(45～98 aa)[4～6.EGFP-SAG1(45～62 aa)、EGFP-SAG1(63～80 aa)、EGFP-SAG1(81～98 aa)]；C.重組蛋白(81～98 aa)[7～11.EGFP-SAG1(82～98 aa)、EGFP-SAG1(83～98 aa)、EGFP-SAG1(84～98 aa)、EGFP-SAG1(85～98 aa)、EGFP-SAG1(86～98 aa),12～16.EGFP-SAG1(81～97 aa)、EGFP-SAG1(81～96 aa)、EGFP-SAG1(81～95 aa)、EGFP-SAG1(81～94 aa)、EGFP-SAG1(81～93 aa),17～21.EGFP-SAG1(81～92 aa)、EGFP-SAG1(81～91 aa)、EGFP-SAG1(81～90 aa)、EGFP-SAG1(81～89 aa)、EGFP-SAG1(81～88 aa)]；D.重組蛋白(84～90 aa)[22～24.EGFP-SAG1(85～90 aa)、EGFP-SAG1(84～90 aa)、EGFP-SAG1(84～89 aa)]

3 討論

多克隆抗體來源于動物血清，盡管可以通過純化IgG來盡量減少其他組分的影響，但并不能排除非特異IgG的影響，所以依然具有較高的非特異性，而且也無法用于一些需要明確具體抗原表位信息的試驗，比如夾心法ELISA試驗，需要識別同一個抗原上2個不同表位的抗體。因此多克隆抗體非特異性概率較高，應用局限性較大。單克隆雜交瘤細胞，理論上分泌的抗體只能識別1個抗原表位，然而，有研究表明超過30%的單克隆雜交瘤細胞會額外分泌多余的抗體重鏈和輕鏈，由于抗體是由2條重鏈和2條輕鏈結合而成，任何多余的重鏈和輕鏈都會造成抗體組成的多樣化，由此造成單克隆抗體的品質下降或者引起非特異性。造成雜交瘤細胞分泌多余抗體重鏈和輕鏈的原因可能有：(1)雜交瘤篩選失誤，多個雜交瘤集合被誤以為只有1個雜交瘤；(2)骨髓瘤細胞融合了多個脾臟細胞；(3)脾臟細胞在體外融合和篩選過程中對抗體表達序列進行重新排列等[10]。重組抗體由表達重鏈和輕鏈的質粒轉染真核細胞表達而來，表達重鏈和輕鏈的序列信息都是明確的，生產抗體的真核細胞不會產生多余的重鏈和輕鏈。而且質粒相較于雜交瘤，不存在細胞污染無法復蘇等缺點，可以長期穩定保存，隨取隨用。因此，重組抗體具有極高的特異性和穩定性。

本試驗制備了弓形蟲SAG1雜交瘤細胞，通過兼并引物進行PCR將SAG1的重鏈和輕鏈克隆到重組抗體表達質粒，并在重鏈的C端插入mCherry熒光基團，使得重組抗體不僅可以應用于免疫印跡試驗，還可以在免疫熒光試驗中直接標記弓形蟲。本試驗制備重組抗體的方法簡便有效，過程無需大型儀器，能夠在基礎試驗平臺開展，適用于絕大多數實驗室。

弓形蟲感染診斷目前大部分依靠酶聯免疫吸附檢測方法(ELISA)，該方法主要使用弓形蟲表面抗原蛋白(SAG)或者排泄分泌物蛋白(ESA)來檢測弓形蟲感染后產生的抗體[11-12]，但是該方法不適用于新生兒感染和免疫缺陷或抑制患者(艾滋病毒HIV患者和器官移植患者)，因為新生兒免疫系統發育尚未成熟，難以形成弓形蟲抗體，而免疫缺陷患者的免疫系統遭到破壞，抗體生成系統紊亂。在這2種情況下，運用弓形蟲特異抗體，比如SAG1抗體，可以通過免疫印跡或者dot-ELISA方法對患者進行診斷[13]。不同亞型弓形蟲的SAG1蛋白相對保守，雖然SAG1蛋白只占弓形蟲全部蛋白的3%左右，但是弓形蟲感染動物產生的血清中有大概50%的抗體識別SAG1[14]，因此，SAG1是診斷弓形蟲感染的良好指標。本試驗鑒定了SAG1重組抗體識別的抗原表位，明確的表位信息使得該重組抗體有望成為弓形蟲診斷研發的候選工具抗體。