插入BC株V蛋白的重組新城疫病毒(LaSota株)毒力鑒定及對先天性免疫的影響

于 桐，南福龍，王 政，于成東，孟 媛，李亭玉，蔡錦順，魯會軍，金寧一

(1.延邊大學 農學院，吉林 延吉133002；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林 長春130122；3.吉林大學 動物醫學院，吉林 長春 130062)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的急性高度接觸性動物傳染病，自1926年發現以來，在全球有過4次大流行，給世界家禽養殖業造成巨大經濟損失[1-3]。NDV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的有囊膜的單鏈負股、不分節段的RNA病毒[4]，具有多種基因型和唯一的血清型，血清型可再進一步分為Ⅰ和Ⅱ類[2]。從1946年我國首次分離到NDV F48強毒株至今，我國流行的毒株已經由Ⅸ型轉變為Ⅶ型[5-6]，由于危害廣泛,其致病和免疫機理成為研究的重點[7]。

基因Ⅱ型中等毒力NDV Beaudette C(BC)株長度為15 186 nt，NDV的P基因可通過RNA編輯機制在轉錄產物484位點(UUUUUCCC)插入1或2個非模板G，從而編碼非結構蛋白V和W[8]。NDV的V蛋白能夠拮抗宿主細胞IFN系統抑制IFN-β的生成，在病毒免疫逃避機制中起著至關重要的作用，但W蛋白功能目前尚不清楚[9]。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT)通路是重要的先天性免疫的信號通路，能夠調節機體免疫系統，磷酸化 STAT1 是該信號傳導通路上的關鍵蛋白，而模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)是宿主細胞抵抗病毒感染的重要防線，黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)是胞漿內的核酸受體，能與病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相結合,特異性地識別雙鏈 RNA，通過自身級聯激活和招募結構域，從而激活轉錄因子，活化后的轉錄因子會進入細胞核，促進 IFN 的表達[10]，因此檢測 P-STAT1 和 MDA5 的表達水平對探討外源V蛋白對先天性免疫反應的影響有重要意義。

本試驗為研究NDV中等毒力BC株V蛋白在感染過程中對毒力的提升和對先天性免疫及IFN拮抗作用的影響，測定了其雞胚平均死亡時間(mean death time,MDT)、腦內致病指數(intracerebral pathogenicity index,ICPI)和靜脈內致病指數(intravenous pathogenicity index,IVPI) 和重組病毒的毒力以及不同時間的感染效率，還檢測了上清IFN-β生成情況，病毒感染12，24 h后P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平，及對DF1和A549細胞先天性免疫分子轉錄水平的影響，為進一步探索NDV V蛋白對先天性免疫及IFN拮抗機制的影響奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料ND重組病毒 rL-BC 株由軍事獸醫研究所分子病毒學與免疫學實驗室保存；重組NDV弱毒 LaSota 親本株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所重要人獸共患病與烈性外來病實驗室保存；9～11日齡SPF雞胚、1日齡的SPF雛雞、6周齡SPF雞均購于哈爾濱獸醫研究所實驗動物管理中心。

1.2 病毒的毒力測定按照 OIE 標準公式測定MDT、ICPI和IVPI：稀釋重組病毒和親本毒并接種 SPF 雞胚，觀察雞胚的死亡情況并計算MDT；并在10只1日齡的SPF 雛雞體內接種稀釋的重組病毒，計算 ICPI；之后靜脈接種10只6周齡SPF雞，觀察雞的發病死亡情況并計算IVPI。

1.3 病毒不同時間的感染效率測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細胞4，8，12 h后，通過間接免疫熒光反應，檢測其不同時間的感染效率。

1.4 病毒感染后IFN-β生成量測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細胞后，分別收取4，8，12，24 h的細胞上清液，利用ELISA檢測試劑盒檢測IFN-β的生成量。

1.5 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平親本毒rL和重組病毒rL-BC 感染后，利用Western blot檢測IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平。

1.6 病毒 mRNA水平的測定重組病毒感染A549和DF-1細胞后提取RNA反轉錄，并進行熒光定量PCR，檢測感染后多種PRRs和IFN下游分子的mRNA轉錄水平。

1.7 統計學分析通過GraphPad Prism 7.0軟件對結果進行方差分析(ANOVA)，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒的毒力測定按照OIE標準測定MDT、ICPI、IVPI，結果顯示，親本毒和重組病毒的MDT均>90 h；測定ICPI時接種重組病毒的雞死亡2只(表1),表明中等毒力BC株V蛋白的插入能提升LaSota株的毒力，但與親本毒相比差別不大，仍屬于弱毒水平。

表1 重組病毒的生物學特性

2.2 病毒不同時間的感染效率測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細胞 4，8，12 h后其感染效率如圖1所示。通過觀察熒光發現，親本毒感染細胞的能力有限，只會感染少量的細胞，而重組病毒感染細胞的數量要多于親本毒，且12 h后已經能感染大部分的細胞。表明在病毒感染過程中，V蛋白的表達能增加弱毒LaSota株的感染效率。

A.4 h rL；B.4 h rL-BC；C.8 h rL；D.8 h rL-BC；E.12 h rL；F.12 h rL-BC

2.3 病毒感染后IFN-β的生成親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細胞4，8，12，24 h后上清IFN-β的生成量如圖2所示。感染后8～24 h親本毒高于重組病毒，12 h時更是有顯著性差異(P<0.001)，這說明V蛋白的插入會抑制IFN-β的生成，從而降低抗病毒效應。

圖2 病毒感染后上清液IFN-β的生成水平

2.4 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平親本毒rL和重組病毒rL-BC感染后IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平如圖3所示。結果顯示，插入外源V蛋白的重組病毒其P-STAT1和MDA5蛋白的表達量低于親本毒，說明重組病毒對這2種蛋白的拮抗作用更強。

M.蛋白質相對分子質量Marker；1.PBS；2.rL；3.rL-BC

2.5 病毒感染后先天性免疫的轉錄水平變化熒光定量檢測插入V蛋白的重組病毒rL-BC和親本毒rL感染后對A549和DF1細胞先天性免疫的影響，結果顯示，在A549細胞中，重組病毒與親本毒相比，多種PRRs及IFN下游分子轉錄水平下降，其中IRF7和ISG15顯著下降(P<0.05)(圖4)；在DF1細胞中，重組病毒rL-BC比親本毒rL感染所誘導的IFN-α、IRF7、LGP2和TLR3轉錄水平下降顯著(P<0.05)(圖5)。說明ND中等毒力BC株V蛋白插入后多種重要先天性免疫分子表達量降低，表明NDV的V蛋白能夠抑制宿主對病毒感染后的先天性免疫反應。

圖4 病毒感染A549細胞24 h后PRRs及IFN通路相關分子的轉錄水平

圖5 病毒感染DF1細胞24 h后PRRs及IFN通路相關分子的轉錄水平

3 討論

副黏病毒科是與黏液蛋白有特殊親和性的一類病毒[11]，NDV作為副黏病毒科的一員，中等毒力毒株和高強毒力毒株會引起多種禽類的嚴重呼吸道疾病甚至死亡[12]。近些年，NDV的感染及致病宿主范圍呈現不斷擴大的趨勢[13]。NDV V蛋白在影響病毒毒力、抑制IFN信號轉導和宿主嗜性等方面起重要作用[14]。為探究BC中毒株V蛋白在病毒感染過程中對先天性免疫反應的影響，本研究測定了rL-BC的毒力和不同時間的感染效率，還檢測了上清中IFN-β的含量以及P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平，最后檢測了感染后DF1、A549細胞的先天性免疫分子的轉錄水平。感染后的Western blot和RT-PCR的檢測結果顯示BC株V蛋白插入后會降低P-STAT1和MDA5蛋白的表達以及多種PRRs如LGP2、TLR3和ISG15及IFN-α等IFN通路相關分子的轉錄水平。據報道，V蛋白對IFN的拮抗作用會影響病毒毒力[15]，V蛋白的缺失會引起病毒毒力的下降[16]，甚至無法在9日齡雞胚中存活。本試驗中V蛋白插入后重組病毒rL-BC的ICPI水平與親本毒相比有提升，破壞細胞的能力也強于親本毒，說明V蛋白插入提高了病毒毒力。NDV和另外幾種副黏病毒的V蛋白可以通過E3泛素連接酶環指蛋白5(RNF5)靶向MAVS造成泛素化降解，而MAVS的降解會導致IFN-β生成通路被抑制，從而有利于病毒的增殖[17]，也能通過參與ERK介導的信號通路促進NDV的復制[3]。本試驗中重組病毒上清的IFN-β生成量低于親本毒也說明了V蛋白的插入會增強IFN的拮抗作用。另外，V蛋白還能與CacyBP/SIP相互作用[18]，靶向降解P-STAT1阻斷IFN-α信號通路調節細胞凋亡和病毒復制[19]。P-STAT1和MDA5蛋白的表達水平下降，也證明V蛋白確實可通過抑制先天性免疫反應從而提高病毒毒力。

當病毒侵入宿主時，宿主會產生抗病毒免疫反應，其中IFN系統和PRRs及下游分子是宿主抵抗病毒感染的重要防線，在早期的天然免疫中發揮重要作用。近年來的研究結果發現NDV通過RNA編輯作用產生的V蛋白具有阻斷IFN抗病毒活性的功能，因而和病毒的致病性有著密切關系[20-22]，所以對V蛋白進行研究對了解病毒致病機制有重要意義。本試驗測定rL-BC毒力和其對先天性免疫的影響，為后續探究V蛋白在感染過程中對IFN和先天性免疫反應的拮抗作用的影響奠定基礎。