豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒感染狀態與抗體水平關聯性分析

張 偉，張子榮，楊力偉，王世銀，劉曉娜，張 力，王忠山

(1.新疆農業職業技術學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆生產建設兵團第六師五家渠市畜牧獸醫工作站，新疆 五家渠 831300；3.新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站，新疆 烏魯木齊 830063)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在我國俗稱“藍耳病”，臨床上以母豬繁殖障礙與生長豬呼吸道疾病、生長遲緩以及死亡率增加為主要特征[1]。PRRSV包括基因1型(歐洲型)和基因2型(美洲型)2個基因型，我國目前檢測到的流行毒株主要為基因2型[2-3]。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)是一種突變能力很強的RNA病毒，這給該病的防控帶來了巨大的挑戰[4]。

我國于20世紀90年代中期暴發PRRS疫情。2007年我國將PRRS列入強制免疫計劃。近年來，通過PRRSV疫苗的持續免疫以及豬場防疫意識、生物安全水平的不斷提高，PRRS在我國的大規模流行得到了有效的控制。但由于PRRSV流行毒株復雜，而目前使用的PRRSV滅活苗和減毒活疫苗(MLV)產生的抗體對不同毒株的交叉保護效果不佳，免疫豬場PRRSV不定期活躍并表現臨床癥狀的情況仍普遍存在[5-6]，加之人們對PRRSV MLV毒株回復突變和毒力返強，以及疫苗毒株與豬群中流行的野毒重組產生新毒株的擔憂[7]，實際生產中對是否免疫PRRSV疫苗仍存在爭論。另外，免疫豬群和自然感染豬群體內PRRSV抗體水平與豬群中PRRSV的感染狀態具有怎樣的關系，以及如何通過豬群PRRSV抗體水平的監測提前預判PRRSV的活躍狀態,進而采取針對性的防控措施，生產中亦有不同的說法，這對我國PRRS的整體或者區域防控非常不利。

鑒于此，本研究在新疆北疆地區選擇了PRRSV感染情況和防控策略不同的3個規模化豬場，對豬群中PRRSV感染和抗體消長情況進行了為期2年的監測，并結合豬群整體生產性能及病毒血癥的發生比例分析了兩者之間的關聯性，旨在為實際生產中PRRSV的科學防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒為IDEXX公司(美國)生產的PRRS X3抗體檢測試劑盒；柱式RNA核酸提取試劑盒為AXYGEN公司產品；Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，AMV反轉錄酶，RNase抑制劑，pMD18-T質粒均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產品；感受態DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器酶標儀、洗板機及普通PCR儀均購自BIO-RAD公司；實時熒光定量PCR儀購自Roche公司；冷凍高速離心機購自Thermofisher公司。

1.3 豬場選擇在新疆北疆地區選擇3個規模化豬場，均采用單點式養殖模式，具有較為完備的生物安全體系。3個豬場PRRSV感染情況和防控策略如下：

A場免疫PRRSV MLV(TJM-F92株)，各階段豬群生產性能穩定，未表現PRRS臨床癥狀。免疫程序：種豬每年普免3次，商品豬14日齡首免，1個月后加強免疫1次。

B場2018年前未免疫PRRSV疫苗，3.0%～5.0%的母豬流產或產死胎、木乃伊胎，保育階段成活率80.0%～85.0%，主要表現為厭食、呼吸困難、精神沉郁、毛發粗亂等癥狀，最終逐漸消瘦死亡。自2018年4月起開始免疫PRRSV MLV(TJM-F92株)，至2018年10月各階段豬群生產性能逐漸穩定至較高水平，僅有個別豬表現PRRS臨床癥狀。免疫程序：2018年種豬每年普免4次，商品豬7日齡首免，3周后加強免疫1次；2019年后調整為種豬每年普免3次，商品豬14日齡首免，1個月后加強免疫1次。

C場2018年前為PRRSV陰性場，2018年3月保育階段首先暴發PRRS并很快波及母豬群，20.0%～30.0%的母豬流產，保育階段豬表現典型的PRRS癥狀，成活率僅為65.0%～70.0%。豬場通過拌料結合肌注抗菌類藥物控制細菌繼發感染，同時加強飼養管理，落實嚴格的生物安全措施，使豬群完成自然感染，至2018年11月豬群生產性能基本恢復穩定，僅保育及育肥階段偶有輕微的PRRS臨床癥狀。

1.4 樣品采集從2018年1月至2019年12月，上述3個豬場每隔3個月采集血樣進行PRRSV抗體和抗原檢測。血樣通過前腔靜脈采集，分離血清進行PRRSV抗體監測，采樣方案為公豬全部采集，后備母豬、妊娠中期母豬和哺乳母豬按照群體數量的10.0%隨機采樣，哺乳仔豬(約10日齡)、保育豬(約40和60日齡)和生長育肥豬(約80日齡)每個單元每次隨機采集50頭份血樣(表1)。抗體陽性血樣混樣(5個血樣混合為1個樣品)使用qRT-PCR檢測PRRSV，以評估檢測豬群表現病毒血癥的情況。另外，每批抗體陽性血樣按照S/P值為0.4～2.5，2.6～3.0以及>3.1共3個等級分別選擇20份血樣使用qRT-PCR檢測PRRSV抗原以評估不同S/P值個體發生病毒血癥的比例。

表1 調查豬場血樣采集數量 份

1.5 PRRSV抗體及抗原檢測參照IDEXX PRRSV X3 ELISA抗體檢測試劑盒操作說明測定血清中PRRSV抗體并計算S/P值，結果判定標準：抗體S/P<0.4為陰性，S/P≥0.4為陽性。

血清中PRRSV抗原檢測采用本實驗室建立的PRRSV qRT-PCR檢測體系完成。引物以PRRSV ORF5基因序列(NC_001961)為參考序列，使用Oligo 6.0軟件設計，并由生工生物工程(上海)有限公司合成,qRT-PCR引物信息見表2。參照試劑盒說明提取血清中的病毒RNA，然后反轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測采用20.0 μL擴增體系：10×Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，引物PRRSV-qP(10 μmol/L)各0.5 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。qRT-PCR反應在Roche LC96上完成。

表2 PRRSV ORF5測序引物及qRT-PCR引物

1.6 PRRSV ORF5基因克隆及測序分別從B和C場隨機選擇2018年3月和2019年3月PRRSV抗原陽性血清中各10份進行PRRSV ORF5基因克隆測序，以確定其感染毒株。以病毒cDNA為模板，使用克隆引物PRRSV-P(表2)擴增PRRSV ORF5基因。采用50.0 μL擴增體系：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，引物PRRSV-P(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共計40個循環；72℃延伸5 min。PCR產物切膠回收，連接T載體后轉化感受態大腸桿菌DH5α，PCR鑒定陽性菌落送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行雙向測序。

1.7 PRRSV ORF5基因序列比對及遺傳進化分析檢索GenBank數據庫，以國內PRRSV主要流行毒株ORF5基因序列作為參考序列(表3)，使用DNAStar軟件的Clustal W算法比對本研究獲得ORF5基因序列和參考序列的同源性，以確定豬場感染的毒株，并使用Mega 6.0繪制進化樹。

表3 序列比對參考毒株信息

2 結果

2.1 調查豬場PRRSV抗體檢測結果從表4數據可以看出，A場通過持續免疫PRRSV MLV，豬群各個階段PRRSV抗體檢測數據均表現良好，在2年的監測期間，種公豬抗體陽性率100.0%，后備母豬、妊娠母豬和哺乳母豬抗體陽性率亦保持在95.0% 以上，且后備母豬2018年3月抗體離散度為42.0%以外，其他階段均低于40.0%，種公豬群抗體離散度甚至可控制在20.0%左右，且全期未檢測到抗體S/P≥2.5的樣本，種豬群PRRSV抗體S/P值穩定在1.8～2.3。商品豬群在2次藍耳疫苗免疫后抗體陽性率亦可達到85.0%以上，抗體離散度達到50.0%以下，抗體S/P值穩定在1.8～2.1。上述檢測結果與該場豬群良好的健康狀況及生產性能相一致。

從表5數據可以看出，B場在2018年4月份免疫PRRSV MLV前豬群PRRSV抗體各項指標均不理想，種豬群抗體陽性率為60.0%～78.0%，抗體離散度99.0%～115.0%，抗體S/P≥2.5的樣本比例為10.0%～30.0%。商品豬群PRRSV抗體各項指標亦很差，80日齡仔豬階段抗體S/P≥2.5的樣本比例高達73.0%。上述檢測數據與該場當時豬群生產性能低下，PRRS臨床癥狀明顯等實際情況相符。

表5 B場PRRSV抗體檢測結果 %

2018年4月份免疫疫苗后至2018年6月份，豬群PRRSV抗體各項指標逐漸出現好轉，至2018年12月份種豬群抗體陽性率90.0%以上，抗體離散度50.0%以下，抗體S/P≥2.5的樣本比例低于5.0%，抗體S/P值平均值為0.9～1.2。商品豬群各項指標改善的相對較慢，至2019年3月基本達到較理想的水平，抗體離散度小于50%，抗體S/P≥2.5的樣本比例低于5.0%，抗體S/P值平均值為0.8～1.1。在2018年10月份，豬群生產性能和PRRS臨床癥狀已有明顯改善，至2019年3月豬場各項生產指標均達到較高水平。

從表6的數據可以看出，C場自2018年3月份暴發PRRS后豬群抗體迅速轉陽，陽性率高達90.0% 以上，至2018年6月種豬群抗體陽性率95.0% 以上，抗體S/P≥2.5的樣本比例為8.0%～13.0%，抗體S/P值平均值為1.6～2.0，商品豬60日齡仔豬群中抗體S/P≥2.5的樣本比例高達41.0%。這與該場同期母豬大量流產，仔豬死亡率高等臨床表現相一致。至2018年12月份豬群基本完成了自然感染，PRRSV抗體各項指標得到根本改善，種豬群中抗體S/P≥2.5的樣本比例控制在5.0% 以下，至2019年3月以后種豬群中再未檢測到抗體S/P≥2.5的個體，豬群抗體S/P值穩定在1.2以下，且種豬群抗體在逐漸轉陰，至2019年12月份種豬群PRRSV抗體陽性率已降至31.0%～41.0%，平均S/P值在0.4～0.8，種豬生產性能亦恢復正常。但該場保育后期PRRSV抗體又重新轉陽，說明豬群又重新感染了PRRSV。

表6 C場PRRSV抗體檢測結果 %

2.2 調查豬場PRRSV抗原檢測結果從表7數據可以看出，A場檢測期間所有血清樣本中均未檢出PRRSV抗原；B場種豬群2018年4次檢測中分別在8.3%，5.1%，6.6%和2.1%的血清樣本中檢測到了PRRSV，但陽性率在逐步下降，至2019年除了6月份檢測到0.5%的陽性樣本以外，其余3次均未檢測到PRRSV；商品豬群血清樣本中PRRSV的檢出率亦在持續降低，至2019年9月以后已全部轉陰。C場種豬群2018年4次檢測中,分別在11.5%，9.3%，4.3%和5.1%的血清樣本中檢測到了PRRSV，陽性率總體呈下降趨勢，至2019年4次檢測種豬群中再未檢出陽性個體；商品豬群在2年的監測期中始終可以檢測到PRRSV陽性樣本，說明PRRSV仍在商品豬群中循環。

表7 調查豬場PRRSV抗原陽性率檢測結果 %

2.3 調查豬場不同PRRSV 抗體S/P值陽性血清的抗原陽性率由表8數據可以看出，B和C場PRRSV抗體S/P值在0.4～2.5的血清樣本，使用qRT-PCR均未檢測到PRRSV抗原，提示抗體S/P值在此范圍的豬未發生病毒血癥；S/P值在2.6～3.0的血清樣本，分別有15.0%和54.0%檢測到PRRSV抗原，而S/P>3.1的血清樣本，分別有78.0% 和100.0% 檢測到PRRSV抗原，提示免疫豬群中S/P值異常高的個體表現病毒血癥的比例亦迅速增高，而非免疫豬群中S/P>3.1的個體100.0%表現病毒血癥。

表8 不同PRRSV 抗體S/P值陽性血清抗原陽性率

2.4 調查豬場PRRSV ORF5基因克隆及測序40份血清均通過PCR擴增獲得大小為754 bp的條帶(圖1)，擴增片段符合預期大小。PCR鑒定陽性菌落(圖1)經測序及序列比對發現，B場20個樣品PRRSV ORF5基因測序結果中分別有11和9條序列相同，分別命名為XJ-01和XJ-02；C場20個樣品測序結果均相同，命名為XJ-03。以上結果說明B和C場分別有2和1個流行毒株，且在2年的檢測期內豬場再未感染新的毒株。

M．DL100 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.部分血清PCR產物;6～9.部分菌落PCR產物

2.5 調查豬場PRRSV ORF5基因核苷酸序列同源性分析將XJ-01、XJ-02和XJ-03共3個毒株ORF5基因核苷酸序列與16個國內流行參考毒株進行序列比對，發現XJ-01、XJ-02和XJ-03毒株分別與JXA1、CH-1a和JXA1毒株ORF5基因序列的同源性最高，分別達到99.8%，99.7%，99.8%，XJ-01和XJ-03毒株與JXA1、TJ、WHH4、GD、HuN4和SXHZ01等毒株ORF5基因序列的同源性也高于99.0%。由于上述毒株均為HP-PRRSV毒株，說明B和C場均有HP-PRRSV毒株感染，同時B場還受PRRSV經典毒株的混合感染(圖2，3)。

圖2 調查豬場PRRSV流行毒株與國內主要毒株ORF5基因核苷酸序列同源性分析

3 討論

3.1 豬群PRRSV抗體監測結果與豬群生產性能的關系目前包括IDEXX PRRS X3在內的PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒，檢測到的是PRRSV N蛋白產生的抗體。但是由于N蛋白產生的抗體無中和病毒的作用[8]，所以測得的PRRSV抗體水平與其保護力沒有直接的對應關系，這給PRRSV抗體檢測結果的分析帶來了很大的困難。

鑒于以上原因，豬場需要結合本場豬群的生產性能、PRRS臨床表現等，對PRRSV抗體檢測結果進行針對性分析，才能對豬群PRRSV的穩定情況做出比較客觀的評價。康樺華等[9]對9個種豬場的檢測數據表明，具有較好生產成績的豬場，其PRRSV抗體基準線的區間范圍為抗體S/P值平均值為1.0～2.0，離散度為50.0%～70.0%，呈動態平穩變化。吳靜波等[10]對粵北地區4個規模化豬場的研究結果表明，豬群生產性能良好的豬場PRRSV抗體陽性率總體應在70.0%～80.0%，抗體S/P值平均值為0.8～1.2，離散度在25.0%左右，S/P值≥2.5的豬只占豬群5.0%以下。本研究中，3個調查豬場PRRSV抗體各項指標亦與豬群生產性能有很好的對應關系。所以，對豬場PRRSV抗體檢測結果進行評價時，除了重視抗體陽性率以外，抗體S/P值平均值、離散度是否處于合理的范圍，以及S/P值≥2.5的樣本數量的高低是需要重點關注的3個指標。

圖3 調查豬場PRRSV流行毒株與國內主要毒株ORF5基因遺傳進化樹

另外，3個調查豬場同批次血清樣本PRRSV抗原qRT-PCR的檢測結果表明，血清樣本PRRSV抗體S/P值與抗原陽性率高度相關，PRRSV抗體S/P值大于2.5的血清抗原陽性率將迅速升高。吳靜波等[10]的檢測結果亦表明，S/P值為0.4～2.5的豬群病毒血癥的發生率為7.3%，其中在S/P值為0.8～1.2的豬群病毒血癥的發生率為0，而73.3%的抗原陽性血清S/P值處于異常范圍(<0.4或>2.5)，與本研究結果基本一致。

通過C場的檢測數據可以看出，采取自然感染或血清馴化的豬場，待豬群生產性能穩定后，PRRSV抗體陽性率、S/P值平均值、以及S/P值≥2.5的樣本數量應逐步下降，若上述指標持續保持高水平或者某個階段出現重新升高的情況，則說明存在PRRSV持續感染或者反復感染的情況。但是隨著豬群中陰性個體數量的不斷增加，豬場再次暴發PRRS的風險也會相應上升。周慶華等[11]調查的豬場PRRS暴發后通過血清馴化使豬群達到PRRSV陽性穩定，但該場在保持陽性穩定2年后又重新暴發了PRRS。

3.2 新疆PRRSV流行情況有關新疆PRRSV流行毒株的研究報道相對較少，趙潔雅等[12]從新疆某豬場分離到NADC30-like毒株，范士龍等[13]也從一個存在嚴重母豬繁殖障礙豬場中檢測到了NADC30-like毒株，說明該毒株已在新疆逐步蔓延。本研究通過PRRSV ORF5基因測序證明B和C場存在PRRSV JXA1和CH-1a毒株的感染，未檢測到NADC30-like毒株，但鑒于PRRSV是一種高度傳染性病毒，各豬場仍應嚴格落實生物安全措施，避免PRRSV新毒株進入豬場。