福建省豬源BVDV流行病學檢測分析及其對CSFV抗體的影響

徐 磊，曾亮明，張體銀，劉毅發，楊 慧，余勛信，林秋敏，劉小龍，傅光華，白泉陽，黃 瑜*，張淵魁

(1.福建農業職業技術學院，福建 福州 350119；2.福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013；3.兆豐華生物科技(福州)有限公司，福建 福州350014；4.福州海關技術中心，福建 福州 350001；5.派生特(福州)生物科技有限公司，福建 福州 350500；6.兆豐華生物科技(南京)有限公司，江蘇 南京 211102)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)呈全球性分布，有2個基因型，即BVDV-1與BVDV-2，和豬瘟(classical swine fever,CSF)病毒、羊邊界病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬[1]。BVDV感染宿主廣泛，可感染牛、豬、羊、駱駝、鹿和多種野生動物，感染宿主的不同及BVDV毒株遺傳背景的不同會引起不同的臨床癥狀[2-4]。豬感染BVDV能引起持續性感染、免疫抑制，常不表現出臨床癥狀或僅表現為亞臨床癥狀，出現類似于溫和型CSF的臨床癥狀和病理變化，其致病機理與臨床類型較為復雜，對豬群危害很大[5-6]。近年來，有研究新發現不同于BVDV-1、BVDV-2的BVDV毒株，被研究者劃分為BVDV-3，由于BVDV與CSF病毒(CSF virus,CSFV)存在廣泛的交叉抗原和血清學交叉反應，這些都給豬源牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea,BVD)和CSF的防控帶來了新的挑戰[7-8]。

目前，各國主要采取對持續性感染動物的檢測和淘汰方法防控BVDV[9-10]。本課題組前期已建立了豬源BVDV特異性抗體和病原檢測方法，敏感性高、特異性強、重復性好，適合用于豬源BVDV的血清學與病原學監測[11-13]?；诖?，本研究采用已建立的ELISA方法[11]和RT-PCR方法[12]分別進行福建省豬源BVDV血清學和病原學檢測，并采用間接血凝試驗(indirect hemagglutination assay,IHA)進行CSFV抗體檢測，以期了解福建省豬源BVDV流行與分布情況及其對CSFV抗體影響，為深入開展豬源BVDV的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒BVDV Oregon C24V株及NADL株均由中國獸醫藥品監察所提供；CSFV由兆豐華生物科技(福州)有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器兔抗CSFV高免血清、CSFV抗體陰性的豬抗BVDV陽性及陰性血清均由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所提供；HRP-兔抗豬IgG為Rockland公司產品；馬血清為Gibco公司產品；酶標板為Corning Costar公司產品；TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor購自寶生物工程(大連)有限公司；CSFV IHA抗體檢測試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；質粒提取試劑盒、pGM-T快連載體、T4DNA ligase、Top 10感受態細胞購自天根生化科技(北京)有限公司；全自動酶標儀為美國BIO RAD公司產品；PCR擴增儀為Eppendorf Mastercycler Gradient AG22331。

1.3 樣品來源16 537份豬血樣分別來自于福建省的福州、寧德、莆田、漳州、泉州、龍巖、廈門、三明、南平共9個地市的293個豬場，包括7 068份CSF疫苗免疫后28 d母豬血樣和9 469份CSF疫苗二免后28 d仔豬血樣。其中，母豬血樣包含4 897份臨床健康母豬血樣和2 171份疑似豬瘟母豬血樣；仔豬血樣包含6 359份臨床健康仔豬血樣和3 110份疑似豬瘟仔豬血樣。

1.4 福建省豬源BVDV抗體檢測豬血樣經離心分離血清，得到16 537份豬血清樣品，按照本課題組已建立的豬源BVDV抗體ELISA檢測方法[11]開展福建省豬源BVDV抗體檢測。

試驗步驟主要包括抗原包被(BVDV Oregon C24V株與NADL株聯合包被)、洗滌、封閉、加阻斷抗體(兔抗CSFV高免血清)、加待檢豬血清樣品、洗滌、加酶標二抗(HRP-兔抗豬IgG)、洗滌、加底物顯色、終止反應。用酶標儀讀取吸光度D450 nm值，若待檢豬血清樣品D450 nm值≥0.28，判為BVDV抗體陽性；否則判為BVDV抗體陰性。

統計BVDV抗體陽性率數據，采用χ2檢驗(chi-square test)分析，P<0.05為差異顯著。

1.5 福建省豬群CSFV抗體檢測豬血樣經離心分離血清，得到16 537份豬血清樣品，按照CSFV IHA抗體檢測試劑盒操作步驟進行福建省豬群CSFV IHA抗體效價測定，IHA測定結果以log2x表示。若待檢豬血清樣品CSFV IHA抗體效價(log2x)≥4，判為CSFV抗體陽性；否則判為CSFV抗體陰性。

所得CSFV IHA抗體效價(log2x)數據以中位數(P25,P75)表示，采用Mann-Whitney U檢驗分析，P<0.05為差異顯著。并統計CSFV抗體陽性率數據，采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異顯著。

1.6 福建省豬群BVDV和CSFV抗體水平的相關性分析統計在不同CSFV IHA抗體效價(log2x)中BVDV抗體陽性豬與BVDV抗體陰性豬的各自百分數，采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異顯著。并采用Spearman相關系數對CSFV IHA抗體效價(log2x)與BVDV抗體(D450 nm值)的相關性進行分析，以P<0.05為差異顯著有統計學意義。

1.7 豬源BVDV的抗原檢測從樣品中隨機抽取臨床健康母豬血樣100份、疑似豬瘟母豬血樣100份、臨床健康仔豬血樣100份和疑似豬瘟仔豬血樣100份，共400份豬血樣，提取血樣白細胞待檢。

依據本課題組已建立的豬源BVDV特異性RT-PCR方法[12]，合成特異性引物序列(P1：5′-tagccatgcccttagtaggact-3′，P2：5′-attccatgtgccatgtacagcag-3′)，擴增片段289 bp。對所提取白細胞進行BVDV抗原檢測，每次檢測均設立BVDV Oregon C24V與NADL株、CSFV作為對照。對經凝膠成像掃描儀觀察為目的片段大小的PCR產物，進行克隆、測序，將測序結果與已發表的BVDV的5′-UTR序列的相應區域作同源性比較。并統計BVDV陽性率數據，采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異顯著。

1.8 豬源BVDV抗原與抗體檢測結果分析將1.7中400份豬血樣的BVDV抗原檢測結果及這些豬血樣在1.4中對應的BVDV抗體檢測結果進行數據統計，并以“抗體-/抗原-”表示豬源BVDV抗體與抗原均為陰性的樣品結果，而“抗體-/抗原+”、“抗體+/抗原-”與“抗體+/抗原+”的表示方法與此一致。所得數據采用χ2檢驗分析不同臨床類型豬中上述BVDV抗體+/-/抗原+/-的各項占比，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 福建省豬源BVDV抗體檢測16 537份豬血清樣品經本課題組已建立的豬源BVDV抗體ELISA檢測方法[11]測定，結果顯示福建省豬群BVDV抗體陽性率為35.6%(5 891/16 537)，豬場BVDV抗體陽性率為89.4%(262/293)，9個地市BVDV抗體陽性率為100.0%(9/9)。其中，在福建省9個地市的豬群BVDV抗體陽性率中，南平市最高為39.5%(790/2 002)，廈門市最低為21.0%(239/1 138)；在福建省9個地市的豬場BVDV抗體陽性率中，莆田市為100.0%(28/28)、漳州市為100.0%(33/33)、泉州市為100.0%(29/29)和廈門市為100.0%(21/21)均最高，寧德市最低為73.1%(19/26)(表1)。

分別統計母豬與仔豬BVDV抗體陽性率數據，經χ2檢驗分析顯示，福建省及其9個地市的母豬BVDV抗體陽性率均分別顯著高于仔豬(P<0.05)。福建省母豬與仔豬BVDV抗體陽性率分別為44.1%(3 118/7 068)與29.3%(2 773/9 469)。其中，在福建省9個地市的母豬BVDV抗體陽性率中，福州市最高為52.9%(599/1 132)，廈門市最低為25.2%(122/485)；在福建省9個地市的仔豬BVDV抗體陽性率中，南平市最高為35.3%(431/1 220)，廈門市最低為17.9%(117/653)(表1)。

表1 福建省豬源BVDV抗體檢測結果

分別統計臨床健康與疑似豬瘟豬群的BVDV抗體陽性率數據，經χ2檢驗分析顯示，福建省及其9個地市疑似豬瘟母豬與仔豬的BVDV抗體陽性率均分別顯著高于臨床健康母豬與仔豬(P<0.05)。福建省臨床健康母豬與疑似豬瘟母豬BVDV抗體陽性率分別為36.5%(1 789/4 897)與61.2%(1 329/2 171)，福建省臨床健康仔豬與疑似豬瘟仔豬BVDV抗體陽性率分別為22.8%(1 448/6 359)與42.6%(1 325/3 110)。其中，在臨床健康母豬BVDV抗體陽性率中，福州市最高為46.3%(383/827)，廈門市最低為14.5%(48/330)；在疑似豬瘟母豬BVDV抗體陽性率中，龍巖市最高為73.1%(166/227)，寧德市最低為45.6%(83/182)。在臨床健康仔豬BVDV抗體陽性率中，南平市最高為31.2%(247/792)，廈門市最低為7.2%(32/446)；在疑似豬瘟仔豬BVDV抗體陽性率中，漳州市最高為56.6%(180/318)，莆田市最低為31.9%(128/401)(表2)。

表2 臨床健康豬與疑似豬瘟豬的BVDV抗體檢測結果

2.2 福建省豬群CSFV抗體檢測16 537份福建省豬血清樣品采用CSFV IHA測定，經Mann-Whitney U檢驗分析顯示，BVDV抗體陰性豬的CSFV IHA抗體效價(log2x)顯著高于BVDV抗體陽性豬(P<0.05)，BVDV抗體陰性豬與陽性豬的CSFV IHA抗體效價(log2x)中位數分別為7和3(表3)。

分別統計BVDV抗體陰性豬與陽性豬的CSFV IHA抗體陽性率數據，經χ2檢驗分析顯示，BVDV抗體陰性豬的CSFV IHA抗體陽性率顯著高于BVDV抗體陽性豬(P<0.05)，BVDV抗體陰性豬與陽性豬的CSFV IHA抗體陽性率分別為86.0%(9 151/10 646)和27.3%(1 611/5 891)(表3)。

表3 福建省豬群CSFV抗體檢測結果

2.3 福建省豬群BVDV和CSFV抗體水平的相關性分析統計在不同的CSFV IHA抗體效價(log2x)中BVDV抗體陽性豬與BVDV抗體陰性豬的各自百分數(圖1)，結果顯示，在6≤CSFV IHA抗體效價(log2x)≤11區間內共有8 842份豬血清樣品，其中有95.9%(8 479/8 842)的豬血清樣品為BVDV抗體陰性，即：CSFV IHA抗體效價(log2x)在6～11的豬血清樣品，其BVDV抗體多為陰性。

BVDV抗體陽性的豬血清樣品共有5 891份，其中有88.7%(5 224/5 891)的豬血清樣品CSFV IHA抗體效價(log2x)≤4(CSFV抗體水平較低)，即：BVDV抗體陽性的豬血清樣品，其CSFV IHA抗體效價(log2x)普遍較低(≤4)。BVDV抗體陰性的豬血清樣品共有10 646份，其中有16.6%(1 769/10 646)的豬血清樣品CSFV IHA抗體效價(log2x)≤4(CSFV抗體水平較低)，經χ2檢驗分析，該百分比(16.6%)顯著低于BVDV抗體陽性豬(88.7%)(χ2= 8 066.4,P<0.05)(圖1)。

圖1 不同CSFV IHA抗體效價中BVDV抗體陽性豬與陰性豬的各自百分數

采用Spearman相關系數對CSFV IHA抗體效價與BVDV抗體的相關性進行分析，Spearman相關分析結果顯示，CSFV IHA抗體效價(log2x)與BVDV抗體(D450 nm值)呈負相關(r=-0.819,P<0.05)(表4)。

表4 豬群BVDV抗體和CSFV抗體的相關性分析

2.4 豬源BVDV的抗原檢測應用本課題組已建立的豬源BVDV特異性RT-PCR方法[12]對400份樣品進行檢測及克隆、測序，結果顯示(圖2)，共有61份樣品RT-PCR擴增產物為289 bp大小的DNA片段，且此61份樣品基因片段核苷酸序列同源性在97.6%～99.8%，與GenBank中發布的BVDV NADL株的核苷酸序列同源性為88.3%～98.1%，而與BVDV Oregon C24V株的核苷酸序列同源性在90.0%～99.2%之間。由此可見，本研究中測定的61份陽性樣品的基因序列同源性較高，而豬血樣BVDV陽性率為15.3%(61/400)。采用χ2檢驗對BVDV陽性率數據進行分析顯示，豬血樣BVDV陽性率由高至低依次為：疑似豬瘟母豬血樣22.0%(22/100)、疑似豬瘟仔豬血樣17.0%(17/100)、臨床健康母豬血樣13.0%(13/100)和臨床健康仔豬血樣9.0%(9/100)，但差異不顯著(χ2=7.2,P≥0.05)(表5)。

表5 豬源BVDV檢測結果

M.DL2000 DNA Marker；1.豬陽性血樣RT-PCR產物；2.CSFV RT-PCR產物；3.BVDV Oregon C24V RT-PCR產物；4.BVDV NADL RT-PCR產物；5.陰性對照

2.5 豬源BVDV抗原與抗體檢測結果分析將400份同時進行了豬源BVDV抗原和抗體檢測的豬血樣結果進行數據統計，結果顯示，400份豬血樣中各項占比由高至低依次為：抗體-/抗原-45.0%(180/400)、抗體+/抗原-39.8%(159/400)、抗體-/抗原+12.0%(48/400)與抗體+/抗原+3.2%(13/400)。經χ2檢驗分析顯示，不同臨床類型豬的BVDV抗體+/-/抗原+/-的構成比差異顯著有統計學意義(χ2=66.2,P<0.05)。其中，100份臨床健康母豬血樣與100份臨床健康仔豬血樣中各項占比由高至低依次分別為：抗體-/抗原-(51.0%與72.0%)、抗體+/抗原-(36.0%與19.0%)、抗體-/抗原+(10.0%與7.0%)與抗體+/抗原+(3.0%與2.0%)；100份疑似豬瘟母豬中各項占比由高至低依次為：抗體+/抗原-62.0%、抗體-/抗原+18.0%、抗體-/抗原-16.0%與抗體+/抗原+4.0%；100份疑似豬瘟仔豬血樣中各項占比由高至低依次為：抗體+/抗原-42.0%、抗體-/抗原-41.0%、抗體-/抗原+13.0%與抗體+/抗原+4.0%(表6)。

表6 豬源BVDV抗原與抗體檢測結果

3 討論

BVDV感染后，母豬會出現受孕率和產仔數下降、產死胎和流產等繁殖障礙問題；先天性感染的仔豬出生后會形成持續性感染和免疫耐受，長期帶毒并成為傳染源；保育豬會出現被毛粗亂、生長遲緩、腹瀉、消瘦、貧血、結膜炎、多發性關節炎等癥狀[6,13-14]，引起國內外獸醫界極大關注。近年來，各國豬群BVDV感染趨勢日益增加，澳大利亞、愛爾蘭、德國、荷蘭、挪威、丹麥和北美地區的豬源BVDV抗體陽性率達2.0%～43.0%[6,15-16]。我國豬源BVDV感染于1996年在吉林首次發現，之后福建、江西、浙江、河南、湖南、安徽、遼寧和廣西等地均有豬源BVDV感染的研究報道，但主要集中在臨床診斷、病原學檢測方面，對豬源BVDV血清學研究相對較少[13,17]。尤其是已有研究多采用牛源BVDV抗體檢測ELISA商品化試劑盒，進行豬源BVDV血清學研究，在鑒別豬源BVDV抗體與CSFV抗體的特異性上有不足[11,18]?；诖?，本課題組前期建立了鑒別豬源BVDV抗體與CSFV抗體的ELISA檢測方法，并對福州市部分豬群BVDV感染進行了血清學監測，發現福州市豬群BVDV抗體陽性率為34.7%[11]。但是，受區域、樣本數量的限制，研究結果不能完全反映福建省豬源BVDV感染的真實情況。

本研究對福建省主要規?；i場進行了豬源BVDV血清學檢測，范圍涉及9個地市，具有一定的普遍性。結果顯示，福建省豬場BVDV抗體陽性率為89.4%(262/293)，9個地市抗體陽性率為100.0%(9/9)，說明福建省豬源BVDV感染情況較普遍。并且9個地市豬群BVDV抗體陽性率差異明顯(21.0%～39.5%)，平均陽性率為35.6%(5 891/16 537)，其中福州(38.0%)、莆田(36.3%)、漳州(38.8%)、龍巖(39.2%)、三明(39.1%)和南平(39.5%)高于平均陽性率，應為福建省豬源BVDV感染的高流行地區。福建省及其9個地市的母豬BVDV抗體陽性率均分別顯著高于仔豬(P<0.05)，福建省及其9個地市疑似豬瘟母豬與仔豬的BVDV抗體陽性率均分別顯著高于臨床健康母豬與仔豬(P<0.05)，說明母豬與疑似豬瘟豬為豬源BVDV感染的高流行群體。在本研究中，福州市豬源BVDV抗體檢測結果與本課題組前期研究結果比較接近[11]，說明豬源BVDV在福州市豬群普遍流行且相對穩定；而龍巖市豬群BVDV抗體陽性率高于戴愛玲課題組[14]的研究結果(28.6%)，這可能源于采樣時間和抗體檢測方法不同。

豬源BVDV抗體對CSFV抗體的影響，不同研究有著完全不同的結果[14,18-19]。本研究對福建省16 537份豬血清樣品同時進行了豬源BVDV抗體和CSFV抗體檢測及分析，結果顯示，BVDV抗體陰性豬的CSFV IHA抗體效價(log2x)、抗體陽性率均顯著高于BVDV抗體陽性豬(P<0.05)；而且CSFV IHA抗體效價(log2x)在6～11的豬血清樣品，其BVDV抗體多為陰性，占比為95.9%(8 479/8 842)；BVDV抗體陽性的豬血清樣品，其CSFV IHA抗體效價(log2x)普遍較低(≤4)，占比為88.7%(5 224/5 891)；并且CSFV IHA抗體效價(log2x)與BVDV抗體(D450 nm值)呈負相關(r=-0.819,P<0.05)。結果說明，豬源BVDV感染對CSFV抗體存在抑制作用。

為進一步了解福建省豬源BVDV流行病學情況，本研究對400份豬血樣同時進行了豬源BVDV血清學和分子流行病學檢查，結果顯示，豬血樣BVDV陽性率為15.3%(61/400)，與前期研究結果一致[12]。其中，相比臨床健康豬的BVDV感染率為11.0%(22/200)，疑似豬瘟豬有著更高的BVDV感染率為19.5%(39/200)，且不同臨床類型豬的BVDV抗體+/-/抗原+/-的構成比差異顯著有統計學意義(χ2=66.2,P<0.05)，表明疑似豬瘟豬與臨床健康豬的BVDV感染情況差異明顯，豬源BVDV感染在疑似豬瘟豬群中的角色有待進一步研究。對61份BVDV陽性樣品的擴增產物測序結果分析表明，福建省豬源BVDV毒株的基因序列相似性較高。結果還顯示，45.0%的豬呈抗體-/抗原-，說明豬未感染過BVDV；39.8%的豬呈抗體+/抗原-，說明豬產生了BVDV抗體；3.2%的豬呈抗體+/抗原+，說明豬處于病毒血癥階段。值得一提的是，12.0%的豬呈抗體-/抗原+，說明豬處于BVDV感染初期機體暫未產生抗體，或者持續感染。這類豬在臨床健康豬和疑似豬瘟豬中均有存在，會長期持續排毒，是豬源BVDV的貯存庫和傳染源，應予以重視。