乳制品中糠氨酸檢測方法改進

□ 黃文強 內蒙古乳業技術研究院有限責任公司 內蒙古伊利實業集團股份有限公司 蘇玉芳 內蒙古乳業技術研究院有限責任公司

張彩霞 內蒙古伊利實業集團股份有限公司

糠氨酸是美拉德反映的初期產物之一，高溫有利于美拉德反應的發生，長時間低溫也能發生反應[1]。乳制品中參與反應的主要是賴氨酸與乳糖，賴氨酸是人體合成各種蛋白質所需的重要物質，缺少賴氨酸，其他氨基酸會受到限制或得不到利用，影響人體對乳制品營養的吸收[2]。通過測定糠氨酸的含量可以評價美拉德反應的程度，而美拉德反應的程度與牛奶產品加工過程中的加熱類型和強度直接相關聯，反映了成品液態奶工藝與品質的優劣[3-4]。我國農業部早在2005年發布行業標準將巴氏奶、超高溫滅菌乳中的糠氨酸含量作為鑒定是否為復原乳的因子之一[5]，同時對于生產企業，原奶的糠氨酸含量可作為原奶是否摻入復原乳（奶粉）的判定因素，因此生產企業建立穩定、高效的乳制品糠氨酸的測定方法具有十分重要的意義。本文對2016年發布的行業標準《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》（NY/T 939-2016）的糠氨酸檢測方法進行了改進，可持續、大量的檢測樣品，可檢測1 000份樣品以上且色譜柱性不會受到影響，同時方法精密度（變異系數）小于1%，回收率為90.6%～93.8%。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸，甲醇（色譜純），三氟乙酸（色譜純）。

1.2 糠氨酸標準品：

用3.0 moL/L鹽酸溶液將糠氨酸標準品（品牌Iris）配成150～ 200 μg/mL的標準儲備液，用0.1%三氟乙酸溶液或者水配制成濃度梯度約為0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、 2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL的標準工作液。

1.3 儀器設備

四元梯度液相色譜儀配有紫外或DAD檢測器（安捷倫科技有限公司），C18SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司），凱氏定氮儀，烘箱（110℃±2℃），帶密封螺紋蓋20 mL耐熱玻璃試管，萬分之一天平。

1.4 檢測操作

1.4.1 樣品水解液的制備

取2 mL待測樣品置于帶密閉蓋的耐熱玻璃試管中，加入6 mL的 10.6 moL/L的鹽酸溶液混勻，密閉試管，然后將其置于110 ℃干燥箱中加熱水解過夜（12 h以上），加熱約1 h后，取出晾涼后搖勻一次，次日加熱結束后，取出冷卻后濾紙干 過濾。

1.4.2 樣品水解液中糠氨酸測定

準確吸取1 mL的樣品水解液到試管中，準確加入5 mL 0.1%三氟乙酸溶液，混勻，0.45 μm濾頭過濾。

1.4.3 樣品水解液中蛋白質測定

依照《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5-2016）計算水解液蛋白質含量m。

1.5 糠氨酸的液相色譜儀測定

1.5.1 糠氨酸檢測的色譜參考條件

柱溫箱32 ℃，紫外檢測波長 280 nm，進樣體積10 μL，流動相A：甲醇，流動相B：0.08%～0.10%三氟乙酸溶液（依據實際分離效果確定），流速1.0 mL/min。泵梯度洗脫程序：0～7 min，流動相A由0%升 至10%，流動相B由100%降至90%；7～10 min，流動相A由10%升至30%，流動相B由90%降至70%；10～20 min，流動相A由30%升至90%，流動相B由70%降至10%；20～25 min，流動相A由90%降至10%，流動相B由10%升至90%；25～32 min，流動相A由10%降至0%，流動相B由90%升至100%；

1.5.2 測定

采用10%流動相A與90%流動相B進行基線平衡，再開始樣品測定。

1.6 樣品糠氨酸含量計算公式

式中：W-樣品中糠氨酸含量，mg/100 g蛋白質；C-樣品水解液糠氨酸濃度，μg/mL；D-水解液糠氨酸稀釋倍數或定容體積；m-樣品水解液中蛋白質濃度，mg/mL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

糠氨酸標準曲線線性方程為y=32.561x-0.1338，線性相關性0.999。

2.2 回收率

以生牛乳作為加標本底進行3個濃度梯度的加標回收，回收率結果見表1。結果表明，在100～200 mg/100 g 蛋白質的濃度下，不同加標濃度的回收率為90.6%～93.8%。

表1 糠氨酸不同加標濃度的回收率結果

2.3 精密度

隨機對一滅菌乳樣品進行了7次糠氨酸檢測，檢測結果分別為 134.4 mg/100 g蛋白質、136.9 mg/100 g 蛋白質、135.2 mg/100 g蛋 白 質、134.3 mg/100 g蛋白質、136.8 mg/100 g蛋白質和135.0 mg/100 g蛋白質，方法精密度RSD為0.73%。

3 結論

相比行業標準中的液相色譜法，該方法采用流動相或水配制工作液，未采用腐蝕性的鹽酸，避免高濃度鹽酸對進樣器和色譜柱的損傷，保護了儀器設備。本方法選擇了更耐受純水溶液及低酸度流動相的反相色譜柱，保證檢測效果，延長了色譜柱使用壽命，經實際實驗應用，至少可測試 1 000個樣品以上，相對于普通的C18反相柱僅可檢測300個左右的樣品有了大幅度改進。