靜態頂空-氣相色譜測定酒中甲醇方法的探究

□ 何焜鵬 何燕欣 廣東省食品工業公共實驗室 廣東省食品工業研究所有限公司 廣東省食品質量監督檢驗站

甲醇是一種對人體有害的物質，易在體內蓄積，長期少量攝入甲醇也會造成體內許多臟器的慢性損傷[1-2]。甲醇在人體內可被乙醇脫氫酶代謝成甲醛，還可能被醛脫氫酶轉化為甲酸，從而引起代謝性酸中毒。甲醇毒性很大，人體攝入5 g就會出現嚴重中毒現象，超過12.5 g可導致死亡[3-4]。《食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒》（GB 2757-2012）中對甲醇含量作出了限定，梁谷類≤0.6 g/L，其他類 別≤2.0 g/L（按100%酒精度折算）。通常采用《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》（GB 5009.262-2016）測定樣品中的甲醇。酒精、蒸餾酒及其配制酒可加入內標直接進樣的測定，但發酵酒及其配制酒還需進行蒸餾處理。酒在發酵過程中會產生氨基酸、果膠、維生素等營養物質，鋅、硒等多種微量元素以及植物源抗氧化 劑[5-6]，這些復雜成分直接進入色譜系統會造成儀器和色譜柱的污染，同時前處理過程中蒸餾操作會花費大量的人力物力。通過頂空進樣的方式，可以高效處理樣品并減少基質對儀器的污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設備

Agilent 7890B氣相色譜儀配置FID檢測器（安捷倫科技有限公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；G 1888頂空進樣器（安捷倫科技有限公司）；十萬分之一天平（奧豪斯有限公司）。

1.1.2 試劑、標準品

甲醇標準品，純度≥99.9%，BePure；乙醇，色譜純，霍尼韋爾公司；超純水，一級，Milli-Q。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

14%無水乙醇溶液：移取70 mL無水乙醇于500 mL容量瓶中，定容至刻度線，混勻待用。

甲醇儲備液（10 mg/mL）：準確稱量0.25 g（精確到0.000 01 g）標準品，用14%無水乙醇溶液定容至 25 mL容量瓶。

1.2.2 樣品前處理

均勻混合樣品，從中準確移取10.0 mL于20 mL頂空瓶，密封頂空瓶蓋，待測。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：CP-Wax 57（50 m×0.25 mm ×0.22 μm）；柱溫升溫程序：初始溫度50 ℃保持3 min以每分鐘5 ℃的速率上升至100 ℃保留3 min；進樣口：溫度250 ℃；進樣量1 mL，分流進樣，分流比5∶1，分流流量為 12 mL/min；氫火焰離子化檢測器（FID）：溫度300 ℃，氫氣40 mL/min，空氣350 mL/min，尾吹30 mL/min；載氣：高純氮氣，尾吹25 mL/min；色譜柱流量1.5 mL/min；平衡條件：平衡溫度60 ℃，定量環溫度70 ℃，傳輸線區溫度80 ℃。

2 結果與分析

2.1 測定化合物分析

甲醇在特定的頂空條件下，目標物在氣相和液相間形成動態平衡，通過測定分析頂空瓶上層的氣體含量，對目標化合物進行定量定性分析，其標準色譜圖見圖1，與空白樣品的比較，其保留時間為5.336 min。

圖1 甲醇標準品色譜圖

2.2 色譜柱選擇的探究

本法選用多款色譜柱測定樣品中甲醇，探究適合該方法的色譜柱。配制濃度均為200 mg/L的標準濃度點，采用1.2的方法進行實驗。使用DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-17（30 m×0.25 mm×0.25 μm）時，甲醇響應值低且峰型差，分析得知，甲醇有較強的極性，采用弱極性柱、非極性柱、中極性柱不能很好的保留目標化合物，為保證甲醇有較好的保留和分離，本方法將采用極性柱進行測定。

使用DB-Wax（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）測定甲醇，峰型尖銳且對稱，測定葡萄酒樣品時候發現甲醇和乙酸乙酯的峰完全重合，不能進行定量定性分析。通過降低初始溫度、減緩升溫速率、調小色譜柱流速的方式，均不能很好的實現分離（見圖2）。此時考慮采用更好分離性能的色譜柱，CP-Wax 57 （50 m×0.25 mm×0.22 μm）成功實現了乙酸乙酯和甲醇的分離（見圖3），目標物出峰尖銳對稱，在濃度均為 200 mg/L下響應值與DB-WAX相近，相比DB-5和DB-17色譜柱響應值較大，各種色譜柱的響應值比較見表1。

圖2 DB-Wax測定葡萄酒中甲醇的標準色譜圖（甲醇和乙酸乙酯重合）

圖3 CP-Wax 57測定葡萄酒中甲醇的標準色譜圖（甲醇和乙酸乙酯實現分離）

表1 不同色譜柱測定甲醇的響應值

2.3 頂空平衡溫度與平衡時間的探究

配制均為200 mg/L的標準濃度點，控制頂空平衡時間為30 min。頂空進樣設置的平衡溫度范圍為40～230 ℃，平衡溫度過高，頂空瓶內壓力升高，樣品沸騰，可能導致頂空瓶內樣品氣體泄漏或頂空瓶破裂等情況，故本試驗在40～80 ℃進行試驗探究。在40 ℃、50 ℃、60 ℃、 70 ℃和80 ℃的平衡溫度下統計相同濃度標準點平行6次測定的平均響應值，探究本實驗較優的頂空平衡溫度，測試結果見圖4。控制頂空平衡溫度為60 ℃，標準濃度點在平衡時 間 為10 min、20 min、30 min、 40 min和50 min下進行測試，在不同平衡時間下平行測定6次響應值，用于探究較優的平衡時間，測試結果見圖5。從圖得知，當平衡溫度為 60 ℃平衡時間30 min時，甲醇達到最大的響應值，繼續提高溫度和增加平衡時間均不能提高目標物的響應值。因此，將頂空平衡溫度為60 ℃，頂空平衡時間為30 min作為本方法的頂空 條件。

圖4 頂空平衡溫度與響應值關系

圖5 頂空平衡時間與響應值關系

2.4 方法的線性范圍及檢出限

從甲醇標準儲備液（10 mg/mL）中 分 別 吸 取0.06 mL、0.25 mL、 0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和2.50 mL用14%乙醇溶液定容至 25 mL，配制成25 mg/L、100 mg/L、 200 mg/L、400mg/L、800 mg/L、 1 000 mg/L的標準工作使用液。準確移取10.0 mL于頂空瓶上機測定。以標準工作液濃度為橫坐標，甲醇峰面積為縱坐標，繪制校正曲線見圖6，線性回歸方程為Y=0.072 0X+1.150 0，線性擬合R=0.997 82，線性良好，符合《實驗室質量控制范圍 食品理化檢測》（GB/T 27404- 2008）附 錄F.2中對相關系數的要求。將標準品儲備液逐級稀釋，以信噪比S/N=3時的濃度為本方法的檢出限0.4 mg/L。與《食品中甲醇的測定》（GB 5009.262-2016）中檢出限為7.5 mg/L相比，本方法可測定更低濃度的樣品。

圖6 甲醇的校正曲線圖

2.5 樣品加標回收實驗和重復性實驗

從市場購得的多種樣品按照1.2方法，在3個不同添加水平下，進行加標回收實驗和精密度實驗，結果見表2。結果均符合《實驗室質量控制范圍 食品理化檢測》（GB 27404-2008）附錄F.1中對回收率和精密度的要求。

表2 不同基質不同添加濃度下甲醇的回收率和精密度（n=6）

2.6 檢測標準的測定結果比對

將本方法結果與《食品中甲醇的測定》（GB 5009.262-2016）的結果進行比較，平行測定6次。統計數據，確認本方法與標準方法的結果是否有較大差異，結果見表3。從數據得知，在不同基質下，本方法的結果與標準方法相近，相對偏差較小，能滿足檢測的要求。

表3 多種基質在不同方法下的測定值（n=6）

3 結論

本方法采用頂空進樣方式測定酒中甲醇含量，對色譜柱的選擇、頂空條件的確定、樣品回收率及穩定性、方法比對等方面進行了探究。改進了《食品中甲醇的測定》（GB 5009.262-2016）中發酵酒、配制酒及顏色較深酒的前處理時需要蒸餾、定容等繁瑣的步驟。采用頂空進樣方式，減少了各種基質中脂類、糖分、蛋白質等物質對色譜系統的污染。目標化合物的線性相關系數良好、樣品的加標回收在正常范圍內，精密度高，符合《實驗室質量控制范圍-食品理化檢測》（GB 27404-2008）中的要求,且簡單高效，適用于檢測各種酒中甲醇的含量。