肺結核患者標準治療過程中GSTs基因多態性與抗結核藥物血藥濃度相關性研究

張 敏，李星星，何 霞，袁 麗，程 希，童榮生

(1.成都中醫藥大學附屬醫院藥學部，四川 成都 610071；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部，四川 成都 610072；3.電子科技大學醫學院/個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072)

谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione S-tranaferase，GSTs)是一種由多個亞家族組成二相代謝酶，GSTM1、GSTT1和GSTP1是其主要的亞組成員，在消除有毒中間代謝物中發揮著重要作用[1，2]。目前GSTM1、GSTT1和GSTP1與抗結核藥物誘導的肝損傷(druginduced liver injury during anti-TB treatment，AT-DILI)相關性研究存在爭議[3，4]，而GSTM1、GSTT1和GSTP1與抗結核藥物異煙肼、利福平等血藥濃度具有相關性卻鮮有報道。本文將研究肺結核患者的GSTs基因多態性與結核標準治療方案治療后血漿中抗結核藥物血藥濃度的相關性，為進一步研究GSTs與AT-DILI相關性提供臨床基礎數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究經成都中醫藥大學附屬醫院和四川省醫學科學院·四川省人民醫院倫理委員會批準，采用前瞻性研究的方法納入2019年1月至 2020年12月在成都中醫學院附屬醫院和四川省醫學科學院·四川省人民醫院診斷為肺結核的60名住院治療患者。納入標準：①根據世界衛生組織《結核病管理指南》以及中國《抗結核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》[5，6]確診的或臨床診斷為肺結核的患者；②年齡16～70周歲。排除標準：①不使用異煙肼等一線抗結核藥物標準治療方案進行治療的患者；②不能獲取患者抗結核藥物前后完整相關生化指標檢測值或數據情況的病例；③入組前肝功能異常或合并患有病毒性肝炎，脂肪肝等對肝功很大影響的患者；④合并服用有其他說明書中肝毒性為主要不良反應藥物的患者，如化療藥物、部分抗菌藥物、大劑量對乙酰氨基酚等。

在接受抗結核治療前應用聚合酶鏈反應 (PCR)-芯片雜交技術測定 GSTs基因亞組GSTM1、GSTT1和GSTP1位點的基因型。開始抗結核治療日期，抗結核治療藥物及其劑量，檢測異煙肼、利福平、吡嗪酰胺三種目前血藥濃度與AT-DILI發生相關性較明確的藥物血藥濃度[7～10]。

1.2 方法

1.2.1給藥方案 按照世界衛生組織推薦的一線抗結核治療方案為：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)強化治療2個月，INH+ RFP鞏固治療4個月(2IREP+4IR)方案進行治療。在抗結核治療開始后7天采集患者外周血，應用超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)法測定血漿中抗結核藥物濃度，分析 GSTs基因多態性與標準結核治療后抗結核藥物血藥濃度之間的關系。

1.2.2試劑與儀器 血液基因組離心柱型DNA提取試劑盒，中國北京天根生化科技有限公司；GSTP1 Taqman SNP 基因分型試劑盒，美國ApliedBpiosystem公司；GSTM1 / GSTT1基因分型試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；GSTM1 / GSTT1primer，美國 Invitrogen公司；異煙肼標準品規格：每支100 mg，批號：100578-200401，中國食品藥品檢定研究院；吡嗪酰胺標準品規格：每支100 mg，批號：100178-201104，中國食品藥品檢定研究院；利福平標準品規格：每支100 mg，批號：130496-201403，中國食品藥品檢定研究院；NanoDrop 2000型核酸濃度測定儀，實時定量PCR儀ABI7500，美國Thermo Fisher Scientific公司產品；實時熒光定量PCR儀LightCycler?480 II，德國Roche公司；德國Eppendorf公司；Rapid ResolutionZORBAX SB-Aq (3.0*50 mm，1.8 um)，安捷倫公司。

1.2.3基因檢測 ①引物：GSTM1(219 bp)的引物為：Forward：5’-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3’；Reverse：5’-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’[11]，GSTT1(257 bp)的引物為：Forward：5’-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3’；Reverse：5’-GGAAAAGGGTACAGACTGGGGA-3’。BCL為陽性內參，用來排除假陰性結果，BCL (154 bp)的引物為：Forward：5’-GCAATTCCGCATTTAATTCATGG-3’；Reverse：5’-GAAACAGGCCACGTAAAGCAAC-3’。② PCR反應擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s共38個循環，設置溫度改變速率為20 ℃/s。結凝曲線溫度為：95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，最后以0.2 ℃/s 速率升溫至98 ℃，實驗方法詳見參考文獻[12]。

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0統計軟件進行統計分析處理，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗進行比較；不符合正態分布數據以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數檢驗統計分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料60例患者中男42例(70%)，女18例(30%)，漢族人群58例(96.7%)，藏族2例(3.3%)，年齡17～86歲，體重37～75 kg，BMI 15.37～26.22 kg/m2，異煙肼的血藥濃度為0.25～2.11 μg /ml，利福平0.25～19.75 μg /ml，吡嗪酰胺1.00～63.39 μg /ml。

2.2 患者GSTs檢測基本情況GSTM1基因突變22例，突變頻率為36.7%；GSTT1基因突變27例，基因突變頻率為45.0%；GSTP1基因中，野生型(AA型)37例，雜合型(AG型)22例，純合突變型(GG型)1例，總突變頻率(AG型+GG型)為23例。

2.3 基因分布信息Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗Hardy-weinberg遺傳平衡檢驗顯示，GSTM1的基因分布頻率與藥物基因組庫 (PharmGKB)中215名中國人的基因分布頻率滿足Hardy-weinberg遺傳平衡 (P>0.05)；GSTT1的基因分布頻率與藥物基因組庫中445名中國人群的基因分布頻率滿足Hardy-weinberg遺傳平衡(P>0.05)；GSTP1的基因分布頻率與藥物基因組庫中286位中國人群的基因分布相符(P>0.05)。

2.4 方法學驗證

2.4.1精密度試驗 對異煙肼、吡嗪酰胺、利福平血藥濃度檢測進行了低、中、高藥物濃度(異煙肼、利福平1.0、5.0、40.0 μg/ml；吡嗪酰胺4.0、20.0、160.0 μg/ml)的精密度試驗，批內、批間精密度CV值均≤15%滿足要求。

2.4.2穩定性試驗 對異煙肼、吡嗪酰胺、利福平血藥濃度檢測低、中、高藥物濃度藥物(異煙肼、利福平1.0、5.0、40.0 μg/ml；吡嗪酰胺4.0、20.0、160.0 μg/ml)的室溫、凍融穩定性進行了試驗，相對偏差均<15%，異煙肼、吡嗪酰胺、利福平樣品可在室溫下維持8 h的穩定性，樣品凍融3次檢測結果仍穩定。

2.5 各基因型間血藥濃度的比較

2.5.1不同基因型的血藥濃度比較 GSTM1 基因未突變組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度與GSTM1突變組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)；GSTT1 基因未突變組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度與GSTT1缺失突變組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；GSTP1 AA組、AG組、GG組異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。吡嗪酰胺血藥濃度中位數GSTP1 AG+GG組為6.032(7.360) μmol/ml，GSTP1 AA組為11.74(21.170) μmol/ml，兩組間差異有統計學意義(P< 0.05)。見表1。

表1 不同基因型的血藥濃度比較 (μmol/ml)

2.5.2GSTM1&GSTT1不同基因型與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度相關性 GSTM1&GSTT1單突變型/缺失型或雙突變型/缺失型四組間異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 GSTM1&GSTT1不同基因型的血藥濃度比較 (μmol/ml)

3 討論

GSTs通過催化谷胱甘肽(GSH)與具有親電官能團的底物相互反應且促進反應產物排出體外發揮解毒作用[13]，對有毒中間代謝物的形成和解毒有重要影響，其家族GSTM1和GSTT1的基因型是目前國內外研究較多的目標基因，其與AT-DILI相關性目前研究仍存在爭議。GSTs基因多態性與抗結核藥物性肝損傷的相關性卻鮮有報道。本次研究的患者異煙肼均采用0.3 g/d的劑量給藥，其平均血藥濃度為0.46 mg/L，高于文獻中的臨界濃度值0.2 mg/L[14]，GSTs會加速異煙肼有毒代謝物轉化為極性物質從而排出體外，根據化學平衡原理，體內有毒代謝物減少，則異煙肼轉化為有毒代謝物的轉化速率也可能會增快，從而間接影響異煙肼的血藥濃度。然而本次實驗的數據分析顯示GSTs的突變對異煙肼的血藥濃度無明顯相關性，從而推測GSTs并非影響異煙肼血藥濃度的主要因素。利福平的有效臨界血藥濃度為0.0625 mg/L[14，15]，本次研究的患者利福平平均血藥濃度為1.57 mg/L，且在GSTs突變組和未突變組之間沒有顯著差異，GSTs酶不是利福平誘導的AT-DILI的主要因素。

吡嗪酰胺的血藥濃度對結核桿菌的抑制效果有重要作用[16]，同樣也可能對不良反應的發生有影響。本研究結果顯示GSTP1 rs1695不同基因型的吡嗪酰胺血藥濃度有差異，證明GSTP1的基因多態性影響吡嗪酰胺血藥濃度，這一發現在之前的文獻研究中并無報道，為進一步研究GSTs與抗結核藥物血藥濃度以及AT-DILI相關性的研究提供了新的基礎數據參考。基于本研究樣本量有限，僅進行了GSTs基因多態性與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺血藥濃度之間的單因素相關性分析，然而AT-DILI的發生是一個多因素影響結果，在今后的研究中會進一步設立多中心大樣本的研究，可對更多的因素進行探討，建立預測AT-DILI發生的模型，為結核患者的個體化用藥治療提供臨床參考工具。