胃俞募穴對功能性消化不良大鼠下丘腦代謝產物的影響

陳 媛，石 宇，鄭華斌

(1.成都中醫藥大學針灸推拿學院，四川 成都 610075；2.重慶市北碚中醫院腫瘤科，重慶 400700；3.成都中醫藥大學附屬醫院針灸科，四川 成都 611137)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是一種無器質性改變的功能性胃腸病，具有起病緩、反復發作、病程長的特點，發病率約16%[1]。FD發病機理尚不明確，多與胃竇十二指腸運動紊亂、胃容受性舒張障礙、生活環境、精神心理狀態等有關[2]。目前尚無這一疾病根治方法，治療方式多以改善癥狀為主。大量研究證實[3]，針灸是治療FD的有效方法之一，“胃俞募配穴法”是FD針灸治療的經典配穴。多項研究顯示下丘腦等區域在針刺治療胃腸道疾病中發揮了重要作用[4]。本課題組前期影像學研究中發現，胃俞募配穴能調節FD大鼠下丘腦異常改變的功能連接，改善FD大鼠的疾病狀態。故本研究在前期研究基礎上繼續以FD大鼠為研究對象，重點觀察電針胃俞募穴對FD大鼠下丘腦重要代謝產物的影響，探索電針治療的中樞響應特征，為針刺胃俞募穴治療FD提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究于2018年2～11月完成。選用24只7日齡清潔級SD雄性大鼠乳鼠(合格證號：SCXK(川)2015-030號)，由成都達碩實驗動物有限公司提供。實驗前期于成都中醫藥大學動物實驗室中進行飼養，分裝于3個籠子中，每籠8只，每籠另配母鼠1只提供母乳喂養。為避免嚙齒動物由母嬰分離引起的腸易激綜合征而干預實驗結果，在乳鼠出生后第22天后取走母鼠[5]。采用隨機數字表分為對照組、模型組及針刺組各8只；實驗后期在武漢物理與數學研究所實驗室進行，實驗條件與前期一致。經成都中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會審批備案。

1.2 方法

1.2.1模型制作 模型組和針刺組大鼠采用0.1%碘乙酰胺(美國SIGMA公司)灌胃法、郭海軍夾尾打斗法和不規則喂食法制作FD動物模型[6]。將混合液(0.1%碘乙酰胺+2%蔗糖)灌入大鼠胃中，灌胃量為0.2 ml/d，時間為6天。同時，對照組僅使用2%蔗糖溶液0.2 ml/d進行灌胃，共6天；乳鼠正常喂養至7周齡后，采用夾尾應激法及不規則喂養進行造模。夾尾應激法于每日上午9時、下午3時共實施兩次，每次30分鐘，共14天。夾尾前，用自制棉布包裹塑料夾，以免造成大鼠尾部皮膚嚴重破損而感染。在大鼠尾端1/3處放置塑料夾進行夾尾刺激，激怒大鼠，與籠內其他大鼠打斗。模型組和針刺組，行不規則喂養法，單日禁食，但保持足量飲水，雙日恢復飲食則給予足量食物及飲水；對照組以常規方式飼養，每日足量攝食飲水。

1.2.2干預方法 針刺組根據《實驗針灸學》(2016版)[7]選取“胃俞”穴(第13胸椎棘突下旁開約5 mm)和“中脘”穴(臍上約20 mm)進行針刺。將大鼠用自制鼠衣固定后，使用0.25 mm×13 mm 毫針在“胃俞”穴直刺4～5 mm，在“中脘”穴直刺2 mm，隨后將兩個穴位與G6805-II電針儀(青島鑫生實業有限公司)相連，電針參數設置：波形為疏密波，頻率為2/100 Hz，電壓為2～4 V，頻率與電壓以大鼠不產生過激的反抗行為、穴位處肌肉組織隨電針刺激上下輕微抖動為度，電針時間為20 min。連續治療10天，單日取左側胃俞穴，雙日取右側胃俞穴。模型組與對照組：在針刺組治療的同時，由同一位經驗豐富的針灸醫師，采用相同的方法進行束縛固定，但不給予針刺刺激。于造模前當天、造模后第二天上午8時、干預后第二天上午8時，觀察記錄三組大鼠的毛發狀況、精神狀態、活動情況以及糞便情況。于造模結束當天上午8時以及針刺干預結束當天上午8時，測量三組大鼠的體重并計算其體重增長量。同時，對每日進食量、飲水量均進行測定。測量胃泌素(Gastrin，GAS)時，采用酶聯免疫分析法(南京建成生物工程研究所大鼠胃泌素酶聯免疫檢測試劑盒)分析。胃體重量稱取完畢后，計算胃排空率：胃排空率(%)=[灌胃量-(胃質量-胃凈質量)]/灌胃×100%。

1.2.3下丘腦組織代謝物測定 將取完胃的大鼠放入微波儀(唐山納源微博熱工儀器制造有限公司)進行腦組織加熱固定后取出，分離下丘腦部位。將大鼠下丘腦組織進行稱重、冷凍、振蕩離心、干燥、離心等步驟后，將干燥所得的固體溶于重水，進行光譜分析。BrukerAvanceIII核磁共振波譜儀(德國BrukerBiospin公司)配有反向低溫探針，將其作為氫質子磁共振波譜成像(H Proton Magnetic Resonance Spectroscopy，1H-MRS)儀器，磁場強度為600 MHz，將90°脈沖長度調至約10.1 μs，采集溫度設為298 K，隨機收集樣品的二維NMR光譜，包括J-分辨光譜(JRES)、1 h-1 h全相關光譜(TOCSY)、1 h-1 h相關光譜(COZY)等；在NMRSpec優化程序中設置好峰對齊和整合后，測量波譜曲線，在相應位置尋找下丘腦組織代謝物肌醇(Myo)、γ-氨基丁酸(GABA)、N-乙酰天門冬氨酸(NAA)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、膽堿類化合物(Cho)、谷氨酰胺(Gln)等的特征性波峰；使用TOPSPIN軟件，選擇TSLP作為內參，應用積分算法測得各個化合物對應的峰下面積。

1.3 統計學方法用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間采用重復測量方差進行統計；非正態分布計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較造模前三組大鼠的外觀沒有明顯差別，精神良好、活潑好動、毛發密集。造模后，大鼠大便開始變得稀溏，情緒急躁易怒、攻擊性增強；模型后期，大鼠出現活力下降、倦臥不語、毛發雜亂無光澤、大便臭穢稀溏，而對照組大鼠情緒穩定、精神良好、大便成形，與前期比較無明顯變化。干預后，針刺組大鼠活力有所恢復，情緒狀態趨于穩定、大便由稀轉干，臭穢程度減輕。模型組大鼠一般狀況有所改善，精神狀態逐漸恢復，但外觀方面毛發仍沒有光澤、形體消瘦、喜歡倦臥，大便稀溏較前稍改善。對照組大鼠無明顯改變。

2.2 三組體重、進食、飲水量、胃排空率及胃泌素比較電針干預前，模型組和針刺組大鼠體重、進食量、飲水量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；干預后，針刺組大鼠體重、進食量、飲水量較干預前明顯增加，較模型組也明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 干預前后大鼠體重日增長量、進食、飲水量變化比較

2.3 三組胃排空率及胃泌素比較電針干預后，針刺組大鼠胃排空率高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。針刺組GAS水平較模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 干預后大鼠胃排空率及GAS水平比較

2.4 下丘腦區域重要代謝產物比較電針干預后，模型組下丘腦區域Myo值明顯低于對照組和針刺組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組和針刺組Ala值均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 干預后三組大鼠下丘腦重要代謝產物波譜圖 a：Ala；b：Gln；c：choline；d：Glu；e：NAA；f：GABA-C4；g：Gly；h：Asp；i：GABA-C3；j：Myo-C1C3；k：Myo-C2；l：Myo-C4C6

表3 干預后大鼠下丘腦區域重要代謝產物濃度比較 (μmol/g)

3 討論

FD發病機制復雜，不僅與腦區異常功能結構變化及腦部神經遞質異常表達有關，而且其外周機制與也多種激素有關，如腦腸肽的GAS、生長抑素、血管活性腸肽以及胃饑餓素等。其中，血管活性腸肽、生長抑素主要存在于下丘腦中。下丘腦是間腦的一部分，具有調節內分泌、自主神經、體溫、食物攝入、晝夜節律、情緒活動等功能?？挂钟羲帄W氮平治療FD是通過調節Nesfatin-I一種新型厭食肽發揮作用，而Nesfatin-I也被證實廣泛分布于下丘腦室旁核、下丘腦外側區等腦區[8]。

多項針刺治療胃腸道疾病的中樞機制研究[9～11]表明，下丘腦在FD的疾病進程中發揮著重要作用，針刺可以通過調節下丘腦結構和功能的改變實現對FD的治療作用：針刺通過調節FD大鼠下丘腦中血管活性腸肽含量改善其疾病狀態，降低FD大鼠下丘腦等部位中胃促生長蛋白的表達，通過中樞途徑及外周途徑，促進胃腸動力，改善胃腸道活動。以上研究均證實了針刺對FD大鼠下丘腦的調整作用，這也與本研究實驗結果相互印證。

本研究發現模型組大鼠下丘腦組織的Myo、Ala表達減少，針刺干預后針刺組大鼠下丘腦組織的Myo物質表達顯著增高。Ala有α-alanine和β-alanine兩種同分異構體，可組成人體蛋白質。其中β-alaninebei被證實可以通過多巴胺來進行大鼠食欲的調控，本次實驗中模型組大鼠下丘腦Ala濃度小于對照組大鼠，且前者的體重增長量、進食量、飲水量均小于后者，FD模型制備成功后可能抑制了大鼠下丘腦中β-alanine的分泌，從而造成食欲的下降，最終使大鼠體重增長量、進食量、飲水量均有不同程度的下降，這也表明FD相關癥狀的產生可能與Ala的同分異構體β-alanine減少有關[12]。

Myo是一種類維他命物質，研究顯示[13]口服Myo可在人體中起到抗抑郁的作用。本研究中，模型組大鼠下丘腦Myo濃度小于對照組，同時模型組大鼠的一般情況均差于對照組，這說明模型組大鼠下丘腦中Myo濃度下降，抗抑郁作用降低，從而使大鼠情緒低落，最終造成大鼠一般情況變差，體重降低，進食量減少等癥狀。精神因素也是FD一個重要致病因素[1]。本研究針刺干預后大鼠下丘腦Myo濃度較模型組增加，同時前者的一般情況、體重變化、進食量等也較后者好，結果提示針刺治療可能通過增加大鼠下丘腦Myo濃度來調節大鼠胃容量變化以及改善大鼠的情緒狀態，這課題組前期研究相呼應[14]。

綜上所述，本研究FD大鼠出現下丘腦中Myo、Ala表達降低，而電針胃俞募穴能夠改善FD大鼠的一般情況、體重增長量等指標，可能與針刺影響下丘腦Myo、Ala代謝物的表達來調節胃腸運動有關。