丹白顆粒對宮腔粘連大鼠TGF-β/Smad信號通路及內膜纖維化的影響

譚麗萍, 吳美麗, 任婧婧, 鞏 恒, 潘紅霞, 楊弋弋

(1.中藥制藥共性技術國家重點實驗室, 山東 臨沂 276006 2.山東省青島市婦女兒童醫院婦科，山東 青島 266011 3.河南省南陽市中心醫院醫院婦科，河南 南陽 473000)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)是由于子宮內膜損傷導致宮腔內形成不規則的粘連，可引起經血或宮腔分泌物流通不暢，甚至完全受阻，產生經血潴留、宮腔積液，從而引發痛經、閉經、繼發性感染、不育等[1,2]。IUA由子宮損傷、子宮感染等多種因素引起，其中流產清宮引發IUA最為常見，隨著人工流產率的增高，近年來IUA的發病率呈現上升趨勢，嚴重影響現代女性的生育要求及生活質量[3，4]。很多學者認為子宮內膜損傷過程中內膜纖維化程度加深、纖維瘢痕組織的形成增多是IUA形成的可能機制[5]。轉化生長因子1(Transfer growth factor 1，TGF-β1)是TGF家族成員，與創面修復愈合密切相關，體內高表達的TGF-β1對于纖維瘢痕組織的形成有促進作用，是較強的促纖維化因子，Smad是TGF-β家族的信號傳導分子，TGF-β1活化后與Smad3相互識別，TGF-β1/Smad3信號通路在纖維瘢痕組織的形成中發揮重要作用[6]。目前關于IUA的治療主要是在宮腔鏡下行宮腔粘連分離術，但其復發率較高，因此探究可緩解IUA病情的藥物進行早期治療仍是研究的熱點[7]。丹白顆粒中牡丹皮、大血藤、莪術、當歸等藥物具有調經止痛、活血化瘀、清熱解毒等功效，具有較強的活血、抗炎、抑菌等作用，適用于慢性盆腔炎等婦科疾病，但關于宮頸粘連的療效并不清晰。在查閱資料確定丹白顆粒具有清熱化瘀、祛濕止痛等功效后，本研究通過建立大鼠IUA模型，觀察丹白顆粒對IUA模型的影響，為丹白顆粒對于IUA的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1動物:SPF級健康SD雌性大鼠(廣東省醫學實驗動物中心)，約4月齡，體重為200～260g，生產許可證號：SCXK(粵)2016-0002，動物質量合格證號：省科委2000A027。所有大鼠于本院動物房中飼養，自然光照，溫度25℃，相對濕度55%，自由進食、進水，保持動物房環境整潔、每周清潔一次鼠籠、每天更新食物及飲用水。本研究經動物倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑及儀器:丹白顆粒(牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術、敗醬草、川芎、白芍、土茯苓、白英、白花蛇舌草、墓頭回、椿皮、當歸，批號：Z20090651，規格8g/袋)購于山東新時代藥業；蘇木素染液(批號：YYJK-923)、伊紅染液(批號：230251)、Masson染色試劑盒(批號：G1340)、羥脯氨酸試劑盒(批號：ml064306)購于美國Sigma公司；尼康SMZ745光學顯微鏡(批號：325435)購于上海普赫生物科技有限公司；TGF-β1、Smad3、Smad7、兔抗鼠單抗(貨號：ab08638、ab07994、ab07999)、羊抗兔IgG二抗(貨號：ab150077)、GAPDH(貨號：ab73299)購于美國Abcam公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號P0027、P0011，)購于上海碧云天公司；GIS-500凝膠成像儀(批號：1306412)購于Miulab公司；酶標儀(型號XElx800)購于美國Perkin Elmer公司。

1.3方 法

1.3.1動物模型制備、分組給藥及實驗分配:參考文獻[8]每日10∶00通過陰道脫落細胞法確定大鼠動情周期，持續觀察7d，選取動情期間的大鼠進行手術，術前禁食不禁水12h。將大鼠隨機分為假手術組(15只)和模型組(65只)，參考文獻[9]制備IUA模型，將醫用無菌手術線浸泡于脂多糖生理鹽水溶液(6mg/L)中24h備用，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)將大鼠麻醉后切開大鼠下腹正中部位，找到大鼠“V”型子宮后于宮頸上方約5mm處作長度約為4mm的切口，采用刮勺經切口進行刮宮手術，待宮腔表面有粗糙感時停止刮宮，將提前準備好的脂多糖棉線放入大鼠宮腔內加重感染，用生理鹽水沖洗宮腔后進行縫合，24h后取出棉線，整個手術在無菌環境下進行，假手術組只做開腹及子宮縫合手術。9d后建模結束，觀察到大鼠子宮呈現僵硬、扭曲，剖開子宮腔后顯示管腔結構消失即為模型構建成功，本次實驗造模成功60只，造模成功率為92.31%。預處理給藥劑量參照人體表面積法計算，成年人標準體重60kg，對應給藥劑量為成人的6.25倍，成人每日給藥劑量為24g，則大鼠每日給藥劑量為2.5g/kg，因此設置低、中、高劑量藥物劑量為2.5、5.0、10.0g/kg。將建模成功的大鼠分為模型組、丹白低劑量組(2.5g·kg-1·d-1、丹白中劑量組(5.0g·kg-1·d-1)、丹白高劑量組(10.0g·kg-1·d-1)，每組15只。造模成功后24h開始給藥，假手術組與模型組以等量生理鹽水灌胃，持續灌胃24d。選取5只大鼠的子宮組織進行HE染色及Masson染色，另選5只大鼠的子宮組織進行子宮腔的通透性評分和AFS評分，另選5只大鼠的子宮組織進行膠原含量測定及TGF-β1/Smad3通路相關蛋白表達情況測定。

1.3.2HE染色觀察大鼠子宮組織內膜厚度、腺體數量:給藥結束后24h，每組選取5只大鼠進行HE染色處理，將大鼠麻醉后處死，收集雙側子宮組織。將組織置于生理鹽水中漂洗干凈，采用4%多聚甲醛溶液固定后，經低濃度到高濃度梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后使用切片機進行切片，得到常規病理切片，接著進行蘇木素-伊紅染色(或HE染色)，具體操作按照說明書進行。封片后于高倍鏡下選取5個視野記錄子宮內膜腺體及子宮內膜厚度，取平均值即為大鼠子宮內膜腺體數量及子宮內膜厚度。

1.3.3子宮腔通暢性及AFS評分測定:選取5只大鼠參考文獻[10]測定大鼠子宮腔的通透性評分，將各組大鼠子宮摘除后置于白色濾紙上，用1mL注射器吸入約0.5mL的亞甲藍溶液，由子宮卵巢端向宮腔內推入，根據推入亞甲藍溶液所需的力度及溶液的的體積進行綜合評分，子宮通暢性良好記為0分，通而不暢記為1分，完全不通暢記為2分。參考美國生育協會AFS評分標準[11]評價大鼠的子宮粘連程度，分值越高粘連越嚴重。

1.3.4Masson法檢測大鼠子宮內膜纖維化程度:每組選取5只大鼠，對子宮組織行Masson染色，將石蠟切片脫蠟、蘇木精染核、Masson麗春紅酸性復紅液染色、冰醋酸溶液浸洗、磷鉬酸水溶液分化、苯胺藍染色、經酒精沖洗、二甲苯透明、封片，具體操作按照說明書進行。封片后于高倍鏡下選取5個視野計算子宮內膜纖維化面積比，即子宮內膜纖維化面積與所選視野總面積之比。

1.3.5ELISA法檢測大鼠子宮組織膠原含量:將50mg大鼠子宮組織剪碎后加入胃蛋白酶(5mg/mL)和三氯乙酸(0.5moL/L)消化(4℃，過夜)，離心后的上清液中含有可溶性膠原，沉淀中含有不溶性膠原，根據羥脯氨酸試劑盒說明書的要求測定并計算上清液中羥脯氨酸的含量，以羥脯氨酸的含量反映可溶性膠原的含量。另取50mg大鼠子宮組織剪碎后加入水解液，再根據羥脯氨酸試劑盒說明書的要求進行測定，以得出總膠原含量，二者的差值即為不溶膠原含量。

1.3.6Western blot法檢測大鼠子宮內膜TGF-β1/Smad3通路相關蛋白表達情況:每組選取5只大鼠，采用蛋白提取試劑盒提取大鼠子宮內膜組織中的總蛋白，參照BCA試劑盒說明書的要求測定蛋白濃度，8%分離膠及5%濃縮膠進行電泳，濕轉法轉移至PDVF膜上，脫脂奶粉(5%)封閉1h后添加兔抗鼠TGF-β1、Smad3、Smad7一抗、內參GAPDH(1∶500)4℃孵育過夜，用TBST洗滌后添加羊抗兔IgG二抗(1∶5000)，室溫孵育2h。采用蛋白成像凝膠儀對TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白水平進行定量分析。

2 結 果

2.1大鼠子宮組織病理形態比較:HE染色切片顯示，假手術組大鼠宮腔通暢、腔壁組織結構清晰完整；與假手術組相比，模型組大鼠宮腔消失、腔壁組織呈現粘連狀態、較多炎性細胞呈現浸潤狀態；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組均有一定的改善，其中高劑量組宮腔較為通暢。見圖1。

圖1 大鼠子宮組織HE染色結果(×400)

2.2丹白顆粒對大鼠子宮內膜厚度、腺體數量、子宮通暢性、AFS評分的影響：與假手術組相比，模型組大鼠子宮內膜厚度及腺體數量顯著降低，子宮通暢性評分、AFS評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組大鼠子宮內膜厚度及腺體數量顯著升高，子宮通暢性得到緩解(P<0.05)，且呈現一定的劑量效應關系。見表1。

表1 丹白顆粒對大鼠子宮內膜厚度腺體數量子宮通暢性的影響

2.3丹白顆粒對大鼠子宮內膜纖維化程度和子宮膠原含量的影響：與假手術組大鼠相比，模型組大鼠子宮內膜纖維化面積及子宮組織中的不可溶性膠原含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒各劑量組子宮內膜纖維化面積及不可溶性膠原含量顯著降低(P<0.05)，并呈現一定的劑量效應。見圖2、表2。

圖2 大鼠子宮組織Masson染色結果(×400)

表2 各組大鼠子宮內膜纖維化程度及膠原含量比較

2.4丹白顆粒對大鼠子宮內膜TGF-β1/Smad3通路蛋白表達的影響：與假手術組相比，模型組大鼠子宮內膜TGF-β1、Smad3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Smad7蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組大鼠子宮內膜TGF-β1、Smad3蛋白表達水平呈降低趨勢(P<0.05)，Smad7蛋白表達水平呈升高趨勢(P<0.05)，丹白顆粒各劑量組呈劑量依賴性，見圖3、表3。

表3 各組大鼠子宮內膜TGF-β1/Smad3蛋白相對表達

圖3 各組大鼠子宮內膜TGF-β1/Smad3蛋白相對表達

3 討 論

IUA主要發生在育齡期女性，是常見的婦科疾病之一，且發病率逐年上升。子宮基底膜受到損傷后導致基層暴露，創面的膠原蛋白、炎癥因子等會滲出，宮腔內壁發生一定的接觸，在子宮內膜修復過程中會形成纖維帶，進而產生IUA，常會導致閉經、少經、痛經等不良癥狀[12]，子宮內膜損傷引起的宮腔形態異常會導致不孕、胚胎發育停止、產后大出血、胎盤粘連等不良妊娠癥狀，對于女性的身體健康及生育產生重大影響[13]。子宮內膜損傷是發生IUA的主要原因，因此建立有效的IUA大鼠模型在IUA疾病發生發展研究中占有重要地位。Kong[14]及王顯[15]等通過機械性刮除及感染性損傷建立大鼠IUA模型效果較好，IUA模型大鼠的子宮內膜纖維化程度加深、腺體數量顯著減少、TGF-β1表達顯著升高。本研究通過子宮內膜搔刮后用脂多糖加重感染的多重損傷法構建大鼠模型，研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腔壁組織呈現不同程度的粘連狀態，子宮內膜厚度及腺體數量顯著降低，子宮通暢性評分、AFS評分、子宮不可溶性膠原含量、子宮內膜纖維化面積顯著升高，表明模型組大鼠子宮受損嚴重、宮腔粘連嚴重、內膜纖維化程度較深，揭示IUA模型構建成功。

研究發現IUA與子宮內膜纖維化、宮腔損傷、熱淤內結等聯系密切，子宮內膜受損后，在修復過程中會促進細胞外基質的產生、成纖維細胞的分泌及不溶性膠原的轉化，導致宮腔內較多纖維瘢痕組織的生成，促進子宮內膜的纖維化，進而產生宮腔內壁粘連[16]，基于丹白顆粒的活血化瘀、祛濕止痛的功效，本文用丹白顆粒處理IUA大鼠，研究丹白顆粒對IUA的治療效果。研究結果顯示，與模型組大鼠相比，經過丹白顆粒處理過的大鼠子宮內膜厚度、腺體數量有一定的回升，子宮通暢性、子宮內膜纖維化程度得到緩解，不可溶性膠原含量顯著降低，表明丹白顆粒具有緩解子宮受損及子宮內膜纖維化的作用，對于治療IUA可能具有較好的療效，但其具體機制尚不清晰。

Zhang[17]等研究發現阿司匹林通過抑制TGF-β1-Smad2/Smad3通路抑制子宮內膜纖維化，進而發揮其對IUA的治療作用，李燦宇[18]等研究發現TGF-β1是有效的促纖維化因子，可促進細胞外基質及成纖維細胞的生成，可介導組織纖維化和纖維瘢痕組織的生成，在多種纖維化疾病中呈現高表達，Smad3是TGF-β1的轉錄調節因子，Smad3的高表達可促進纖維細胞膠原的合成，加重宮腔粘連程度。Smad7的表達增加會阻斷TGF-β1與Smad3的結合，進而起到抗纖維化的作用。本研究結果顯示，與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組Smad7蛋白表達水平呈升高趨勢，TGF-β1、Smad3蛋白表達水平呈降低趨勢，與相關研究結果一致，表明丹白顆粒可能通過抑制TGF-β1/Smad3通路活化，進而發揮抗IUA子宮內膜纖維化的作用。

綜上所述，丹白顆粒可有效緩解IUA大鼠引起的子宮內膜纖維化程度，可能與抑制TGF-β/Smad通路有關，但是本研究未進行通路抑制劑及激活劑進行驗證試驗，仍需深入研究。