養心定悸膠囊在缺血再灌注損傷心肌組織中的保護作用研究

王 靜，賈凌梅，劉 暢，欒瑩瑩，賈 敏

(1.河北省石家莊市人民醫院，河北 石家莊 050027 2.河北醫科大學第二醫院心內科，河北 石家莊 050000)

心肌缺血再灌注損傷是臨床經皮冠狀動脈介入治療等治療動脈粥樣硬化，心肌梗死等疾病中的常發的并發癥，嚴重的心肌缺血再灌注損傷可以二次導致心肌冠狀動脈血供不足和多種臨床心血管并發癥[1，2]。缺血/再灌注(I/R)可導致血管功能、代謝和結構異常的發生。大量的證據表明細胞溶質鈣超載和氧化應激反應在缺血/再灌注心肌缺血損傷中扮演重要作用[3]。內源性活性氧參與調節細胞內和細胞內的生物過程，正常條件下機體的抗氧化系統可以平衡體內的氧化應激狀態，但在異常條件下，機體的抗氧化機制破壞，過度釋放的氧自由基，氮自由基可誘導組織損傷發生，導致線粒體的鈣超載。氮代謝異常導致的氮自由基過量是機體氧化應激反應的中除了氧自由基外的另一種重要因子可導致細胞線粒體蛋白的修飾，導致機體氧化應激反應顯著并引起線粒體的電勢的改變，最終引起線粒體損傷的發生[4]。因此改善氮自由基過量以及由其導致的氧化應激反應及線粒體損傷在心肌缺血再灌注損傷中具有重要作用。養心定悸膠囊，由地黃、麥冬、紅參、大棗、阿膠、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草組成。具有養血益氣，復脈定悸的功效。用于氣虛血少，心悸氣短，心律不齊，盜汗失眠，咽干舌燥，大便干結[5]。該藥臨床對于快速性和緩慢性心律失常均有良好的治療效果，其能夠雙向調節心律，提高心功能，改善心率變異性和血管內皮功能。且改善心慌、氣短、乏力、失眠等癥狀。前期的研究發現養心定悸膠囊在改善心肌缺血再灌注損傷誘發的心率失常中具有一定作用，同時對心肌缺血再灌注損傷的發生具有一定保護作用[6]。氮自由基氮代謝異常是導致心肌氧化應激反應的關鍵因素之一，而養心定悸膠囊具有改善氧化應激的作用，但其對心肌缺血再灌注發生時對機體氧化應激反應的影響作用還有待闡明。因此本研究將建立心肌缺血再灌注模型，考察養心定悸膠囊在心肌缺血再灌注損傷中對機體氧化應激反應及心肌氮代謝的影響及調控機制。

1 材料及方法

1.1試劑及儀器:養心定悸膠囊購自石藥集團，SOD，GSH-px，MDA(南京建成生物工程公司)；線粒體提取試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所，中國)；異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)，α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)ELISA試劑盒(sigma，美國)；鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉移酶(SSAT)ELISA試劑盒(sigma，美國)。Mpre200酶標儀(Tecan公司，瑞士)。

1.2實驗動物及模型建立:采用Langendorff離體心臟灌流建立大鼠缺血再灌流損傷模型，大鼠腹腔注射肝素1000U/kg抗凝后，戊巴比妥鈉麻醉。迅速取出心臟，清洗殘留血液后心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，逆行恒壓灌注。剪開右心房，冠脈流出液自然流出。恒溫(37℃)、恒壓(100cm H2O)條件下采用95%O2+5%CO2混合氣飽和的K-H緩沖液(pH值7.35～7.40)灌注。剪開左心耳，將連接有測壓導管的心室球囊送入左心室，另一端連接多導生理記錄儀。灌注液及心臟周圍溫度用恒溫循環水浴維持在37℃±0.5℃。平衡灌注30min，待心臟各項功能穩定，關閉灌流液停止灌流，造成全心缺血，30min后打開灌流液再復灌30min。將30只大鼠分為正常對照組、模型組、停灌前給藥低、中、高劑量干預組、，每組6只。將養心定悸膠囊溶于灌流液中，采用0.45μm微孔濾膜過濾，使終濃度分別為0.05g/L、0.2g/L、0.5g/L。給藥劑量參照臨床用量分別設置高、中、低劑量并按照體表面積折算。正常對照組用正常灌流液灌注。模型組用正常灌流液灌注，平衡30min后，停止灌注30min，復灌30min。停灌前給藥組：正常灌流平衡20min后，分別用含有不同劑量的含藥灌流液灌注10min后，停止灌注30min，復灌30min。

1.3乳酸脫氫酶及肌酸激酶同工酶活性分析:心肌細胞損傷通過測量冠狀動脈內乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，采用商業試劑盒，按照試劑盒說明書，取200μg冠狀動脈，加入PBS勻漿后檢測(Agappediagnostics，印度)。

1.4抗氧化酶及脂質過氧化產物含量檢測:取心肌組織100mg檢測心臟抗氧化酶測定和脂質過氧化含量及活性，測定采用分光光度計檢測。超氧化物歧化酶測定SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)采用試劑盒說明書方法檢測。總蛋白采用Lowry等人的方法進行分析。水平硫代巴比妥酸反應物(TBARS)和脂質過氧化物(LOOH)按照說明書檢測。

1.5多胺含量測定:心肌組織中腐胺、精胺、多胺含量采用高效液相色譜法(LC-6A，島津，高效液相色譜法(LC-6A，島津，日本)。心臟樣本用0.3M冰冷高氯酸，苯甲酰氯進行衍生化，苯甲酰氯衍生物用氯仿萃取。衍生物用超高密度ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm，水，美國)分離。柱洗脫液用紫外檢測器在229nm監測(安捷倫1200，安捷倫公司)。

1.6鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉移酶(SSAT)活性檢測:心肌組織在4℃下勻漿的等分，以30000×g離心20min分別測定ODC和SSAT活性。ODC活性通過測定37℃下0.5μCi的L-[1-14C]鳥氨酸釋放的14CO2量來測量。混合物在37℃下培養60min。通過添加0.8mL 1mM檸檬酸，繼續培養20min。ODC活性以pmol/mg蛋白質表示。將86μl勻漿液添加到含有100mM的反應混合物中Tris-HCl(pH7.8)，3mM亞精胺(pH7.0)，1mM二硫蘇糖醇。然后將該混合物在37℃下培養10min。通過添加20μM鹽酸羥胺進行測定，以22000×g離心5min后檢測。

1.7NO及ONOO-含量檢測:組織用二氫乙胺(DHE，Cat)孵育。37min并小心地清洗冷PBS兩次以去除多余的DHE。用研缽和杵將碎片粉碎液氮。用抹刀將粉末轉移到試管中，加入乙腈。組織樣本離心后，上清液在室溫下轉移并在真空濃縮器中干燥。沉淀層在含有0.1%Triton X-100的溶解緩沖液(Dulbecco's PBS，pH值)中溶解，用BCA蛋白試劑盒(Cat。P0012號，碧云天生物科技，上海，中國)。初始流動相(60μ五十)在渦流前加入干燥樣品注入10μL放入帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀。條件是：λ發射=580nm和λ激發=480nm，柱溫25℃帶進樣量20μL。流動相為90% H2O～10%CH3CN(0.1%三氟乙酸)，流速為1.0mL/min。HPLC柱為Agilent 5 TC-C18。

1.8線粒體相關代謝酶活性檢測:異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)，α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)按照試劑盒檢測說明檢測。取模型鼠心肌組織100mg，勻漿后，采用梯度離心法分離模型鼠線粒體分離，檢測心肌組織相關酶活性。

1.9統計分析:數值表述為均值±標準差,使用SPSS11.5版對數據進行統計分析，采用單因素方差分析法進行統計分析，P<0.05為具有統計學差異。

2 結 果

2.1養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中LDH，CK-MB水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織損傷的發生，LDH、CK-MB是考察心肌組織損傷的經典標志物，實驗結果表明模型組LDH、CK-MB水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著升高，而給與養心定悸膠囊干預的心肌組織中LDH，CK-MB活性有下降趨勢，中、高劑量養心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的LDH，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時中，高劑量組養心定悸膠囊干預后CK-MB活性與模型組具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織LDH CK-MB水平的影響

2.2養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中抗氧化酶及脂質過氧化產物水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織損傷的發生，氧化應激反應是心肌組織損傷的顯著誘因，實驗結果表明模型組抗氧化酶SOD、CAT、GPx水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著降低，而給與養心定悸膠囊干預的心肌組織中SOD、CAT、GPx活性明顯改善，高劑量養心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的CAT、GPx水平，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時中，高劑量組養心定悸膠囊干預后SOD活性與模型組具有統計學差異(P<0.05)。此外模型組脂質過氧化產物TBARS、LOOH含量顯著升高，而養心定悸膠囊干預后模型鼠組織中脂質過氧化產物水平顯著降低與模型鼠具有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中抗氧化酶及脂質過氧化產物水平的影響

2.3養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N-乙酰轉移酶(SSAT)活性水平的影響:缺血再灌注可以導致心肌組織ODC和SSAT活性水平顯著升高，實驗結果表明模型組ODC和SSAT水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，而給與養心定悸膠囊干預的心肌組織中ODC和SSAT活性呈下降趨勢，高劑量養心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的ODC，與模型組，低劑量組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時中，高劑量組養心定悸膠囊干預后SSAT活性與模型組，低劑量干預組均具有統計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多鳥氨酸脫羧酶和亞精胺/精胺N-乙酰轉移酶活性水平的影響

2.4養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多胺，NO及ONOO-水平的影響：多胺類物質是考察心肌組織損傷的經典標志物，實驗結果表明模型組腐胺，精胺，多胺水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，顯著升高，而給與養心定悸膠囊干預的心肌組織中腐胺，精胺，多胺含量均顯著下降趨勢。中、高劑量養心定悸膠囊可以顯降低心肌組織中的精胺、多胺，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時高劑量組養心定悸膠囊干預后腐胺含量與模型組具有統計學差異(P<0.05)。NO及ONOO-含量與胺含量相關，實驗結果表明，模型組NO水平顯著降低，ONOO-含量明顯升高，而給與養心定悸膠囊干預后，組織中NO水平顯著升高，且可抑制ONOO-含量的升高，中高劑量養心定悸膠囊干預均有顯著作用(P<0.05)。見表4。

表4 養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中多胺及NO及ONOO-含量水平的影響

2.5養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中線粒體相關代謝酶活性水平的影響:缺血再灌注可以引起心肌組織能量供應障礙，線粒體TCA循環功能障礙的發生，實驗結果表明模型組線粒體關鍵物質代謝酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均顯著降低水平與對照組具有顯著差異(P<0.05)，而給與養心定悸膠囊干預后，檢測心肌組織中ICDH、SDH、MDH、α-KGDH，結果表明，養心定悸膠囊對線粒體TCA循環關鍵代謝酶活性具有一定的改善作用，中、高劑量養心定悸膠囊可以顯升高心肌組織中的ICDH、MDH、α-KGDH活性，與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)，同時高劑量組養心定悸膠囊干預后SDH活性與模型組具有統計學差異(P<0.05)。見表5。

表5 養心定悸膠囊對缺血再灌注心肌組織中線粒體相關代謝酶活性水平的影響

3 討 論

心肌缺血可導致線粒體ATP的消耗，而再灌注導致活性氧中間體和鈣的生產超載，細胞代謝和生成的毒性分子導致心肌缺血/再灌注損傷的發生。心肌組織中氧，氮自由基的產生和鈣超載是心肌缺血/再灌注損傷發生發展的兩個主要原因，是與其疾病發展有關的重要病理生理學事件[7]。本研究中發現缺血再灌注心肌組織損傷性標志物，LDH、CK-MB水平明顯升高，缺血再灌注心肌組織中氧化應激產物TBARS、LOOH含量明顯升高與正常組具有統計學差異，心肌組織抗氧化酶GPx、SOD、CAT活性顯著降低與正常組具有統計學差異。

多胺(精胺、亞精胺和腐胺)是所有真核細胞的固有成分，是機體含氮的主要內源性物質。它們在細胞程序性死亡、細胞生長和分化、線粒體膜通透性轉變和胞漿鈣穩態中起著重要作用[8]。多胺可參與組織缺血損傷中，如腦缺血、腎臟缺血等缺血/再灌注損傷。鳥氨酸脫羧酶(ODC)和亞精胺/精胺N1乙酰轉移酶(SSAT)分別是多胺生物合成和降解的關鍵酶。ODC將鳥氨酸轉化為腐胺，腐胺被代謝為精胺和亞精胺。SSAT乙酰化精胺和亞精胺形成乙酰化多胺。乙酰化多胺被多胺氧化酶(PAO)轉化為腐胺，在這個過程中，過氧化氫(H2O2)和氨基丙醛大量生成[9]。研究表明心肌缺血/再灌注損傷大鼠，多胺合成和降解中的關鍵酶ODC和SSAT活性水平顯著升高。導致心肌組織含氮的多胺類物質代謝異常，繼而引起心肌氮自由基含量升高，誘發氧化應激反應，導致線粒損傷發生，此外一氧化氮(NO)是調控機體血管功能的關鍵內源性物質。其也可與超氧物反應可生成過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)，而ONOO-可導致心肌缺血/再灌注損傷的發生，損傷血管等組織。研究發現多胺與和NO通路相互影響。有研究表明NO通過抑制ODC活性在改善動脈粥樣硬化[10]。而多胺的大量產生可導致NO氧化為ONOO-加劇血管損傷的發生[11]。

本研究發現，缺血再灌注大鼠模型中，心肌組織氧化應激反應明顯加劇ODC和SSAT活性水平，促進機體多胺的產生，而養心定悸膠囊可明顯改善其作用，降低機體多胺類物質的產生，同時減少機體ONOO-含量，恢復NO含量，改善血管功能。線粒體能量代謝的改變是心肌損傷的關鍵因素。氮代謝異常可導致線粒體損傷的發生，而本研究中發現缺血再灌注可以導致心肌心肌組織中線粒體相關代謝酶活性水平的顯著減低，線粒體關鍵物質代謝酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均顯著降低。而養心定悸膠囊在中，高劑量組干預后，大鼠心肌組織中線粒體能量代謝能力顯著改善。檸檬酸鹽脫氫酶(ICDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)是參與線粒體TCA循環產生ATP的關鍵活性酶。而養心定悸膠囊可顯著改善其活性，因此有助于線粒體的能量生成。養心定悸膠囊，由地黃、麥冬、紅參、大棗、阿膠、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草組成，其中研究表明大棗能明顯阻斷N二甲基亞硝胺的形成，不同配比的芍藥炙甘草可以改變機體NO含量[12]，以上藥材可能參與機體氮代謝的影響，但是目前針對其主要藥材及其活性成分對心肌缺血再灌注損傷機體氮代謝調控的研究尚未報道。

本研究表明養心定悸膠囊可顯著改善缺血再灌注損傷心肌組織氮代謝異常，減少心肌組織胺類物質含量，減少氮自由基，恢復心肌組織線粒體能量代謝，但是養心定悸膠囊參與調控ODC和SSAT活性的分子機制還有待闡明。本研究對于將養心定悸膠囊用于動脈粥樣硬化治療提供了一定的前期基礎，但其后期還有待進一步開展相關臨床研究。