椎間盤退變的基因治療研究進展

李 勇，沈 超，李海峰，阮狄克

椎間盤退變（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）是一系列脊柱退行性疾病的病理學基礎，包括腰腿痛、頸椎病、椎管狹窄、椎間盤突出癥等疾病[1-2]。臨床上高達40%的下腰痛被認為主要是由IDD 引起的，盡管國內外學者對IDD 的治療進行了廣泛而深入的研究[3-4]，但目前對于椎間盤源性背痛的治療仍然極具挑戰性[5]。1997 年日本Nishida 首先開展了IDD基因治療實驗研究[6]。雖然在基因載體的安全性和表達調控方面仍有許多問題需要進一步解決，但是基因治療為IDD的治療提供了一種新的思路和方法，并在近年取得顯著的進步，表1。因此，依據近期發表的文獻，將IDD 的基因治療進展綜述如下。

表1 IDD相關基因及其作用

1 病毒介導的基因治療

1.1 逆轉錄病毒介導的基因治療 逆轉錄病毒為單鏈RNA 病毒,可高效地感染多種類型細胞,將外源基因隨機插入并穩定整合到宿主細胞基因組中持續表達。逆轉錄病毒作為載體的缺點包括：①不能感染非分裂細胞；②轉錄終止能力相對較弱,從而有可能造成轉錄通讀；③可能產生有復制能力的病毒；④可能造成插入性突變。通常逆轉錄病毒的插入位點是隨機的,但更傾向于插入基因的第一個內含子和轉錄起始位點。此外，逆轉錄病毒可包裝的外源基因要求小于8 kb,因此只適用于體外的細胞感染[7-8]。Wehling 等[9]通過逆轉錄病毒載體將兩種外源基因─細菌LacZ基因和人白細胞介素-1(IL-1)受體拮抗劑的互補DNA,從體外轉移到牛尾椎終板分離的軟骨細胞中，并在48 h內成功產生了IL-1受體拮抗劑蛋白。Reinecke 等采用大鼠也得到了類似的結果，也是將LacZ基因和人IL-1ra的cDNA 通過逆轉錄病毒介導導入椎間盤細胞，并檢測到表達。這些研究顯示了局部基因治療IDD 的潛在應用，將外源性的治療基因引入椎間盤細胞和其他脊柱組織，可能會為治療物質輸送到脊柱開辟新的途徑。

1.2 慢病毒介導的基因治療 慢病毒作為載體用于基因治療，其特點是用于各種組織的靶細胞、能承載相對多的基因載荷,可攜帶較大基因組、并可將目的基因高效整合至目的基因組DNA 而穩定表達[8]。慢病毒可以有效地傳遞大量的外源基因，在多基因表達系統中具有明顯優勢，對于分裂期及非分裂期細胞均能夠高效感染。慢病毒載體另一大優點是不易誘發宿主免疫反應。從安全角度來看,慢病毒是一種復制缺陷型病毒載體,因此不會對細胞或人體產生不良感染,屬于低毒性病毒載體。其生物安全性明顯優于逆轉錄病毒,甚至優于非病毒類基因載體。2015年，賽佳明等[10]研究慢病毒載體GVl 15 介導Caspase-3siRNA 轉染人椎間盤髓核細胞，轉染l周后即可表達綠色熒光素，Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量較對照組顯著增高。Ma 等[11]采用慢病毒介導的凋亡抑制因子survivin轉染退變人椎間盤髓核細胞，結果發現：盡管慢病毒攜帶survivin可以成功地在髓核細胞中表達，細胞形態明顯改變，但細胞凋亡率未降低。因此，對survivin基因在椎間盤退變中的治療作用還需進一步評估。2016 年，Liu 等[2]報道了轉化生長因子β3(TGF-β3)、結締組織生長因子(CTGF)和TIMP-1與慢病毒載體在新西蘭大白兔環形穿刺模型中的體內共轉導，結果顯示具有上調蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的基因表達和蛋白合成的作用，并且椎間盤的磁共振成像(MRI)分級評分有顯著改善。這些結果既讓我們看到了慢病毒多基因轉移治療IDD的潛在價值和希望，也發現了存在的問題和不成熟的一面。

1.3 腺病毒介導的基因治療 腺病毒載體介導基因治療也頗受研究者重視，因為它具有體外穩定、易于純化的優點，而且能夠感染終末分化細胞，并且不整合入宿主，避免了插入突變的可能。腺病毒載體也有缺點：①與細胞基因的重組，可能使腺病毒結構蛋白表達，從而引起機體免疫反應；②在特定情況下少量的復制能力，會導致宿主發生腦炎的危險。Nishida 等人[13]報道了體外培養成熟雌性新西蘭大白兔分離的椎間盤髓核細胞，通過編碼lacZ基因的腺病毒構建體(Ad-lacZ)轉導成功的例子，證明了基因治療IDD 疾病的可行性。2016 年，Luo等[14]發現腺病毒不僅是一種有效的基因傳遞載體，而且可以延長人生長和分化因子5（GDF-5）的表達，從而促進髓核細胞后粘多糖和羥脯氨酸含量增加，促進了細胞外基質的產生，這表明Ad-GDF-5組細胞在蛋白和mRNA水平分泌蛋白多糖，Ⅱ型膠原和聚糖蛋白表達上調。因此，利用腺病毒載體將病毒基因轉移到椎間盤髓核細胞的治療方法被證明是可行的，可以通過增強人髓核細胞的細胞外基質生成來恢復退變椎間盤的功能等方式來實現，而且有報道使用腺病毒載體的單次注射，可實現載體基因表達長達1年。腺病毒作為載體的免疫原性,并由此導致的臨床安全問題，這一點一定不能忽略。

1.4 腺相關病毒介導的基因治療 腺相關病毒（AAV）屬于細小病毒科,Dependoparvovirus 屬。它的生命周期依賴于輔助病毒的存在,如腺病毒,目前的共識認為AAV 不會引起任何人類疾病。AAV 作為基因治療最有希望的載體之一[15-16]，其重要特征是在人類中的低遺傳毒性。2012 年，Leckie SK 研究團隊[17]在一項動物實驗中,以AAV為載體,將金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMPs-1）注射到兔退變椎間盤中，結果證實TIMPs-1能夠延緩椎間盤退行性變的發展。Lattermann 等[18]報道了AAV 載體成功地將熒光素酶的基因轉導到兔椎間盤髓核細胞，并與腺病毒的載體進行比較。在處死動物時，Lat‐termann 等發現除了注射部位有軟組織瘢痕形成外，沒有發現椎間盤任何宏觀變化[18]，目前研究發現，AAV 載體的免疫原性低于腺病毒載體，且與人類或哺乳動物的任何已知疾病無關[19]。Ren 等[20]研究探討了AAV 介導的BMP-7和SOX9雙基因體外共轉染人退變性椎間盤髓核細胞的生物學功能，AAV 介導的BMP-7和SOX9體外共轉染可促進人退變椎間盤髓核細胞中Ⅱ型膠原的合成。AAV 是實現椎間盤轉基因治療的一種有價值的新載體，尤其它的低遺傳毒性和低免疫原性的優點，正受到越來越多人的青睞。但是，AAV 作為基因治療載體，與腺病毒載體相比，起效更慢，表達強度更低，因此，它的使用還需要進一步評估。

1.5 桿狀病毒介導的基因治療 桿狀病毒也可以作為基因治療的載體。這種病毒能在體內或體外釋放外源性基因至哺乳類動物細胞,包括不含細胞毒素未分化細胞。有研究發現桿狀病毒介導的某些基因在宿主細胞長期表達并無明顯毒性反應。Liu 等[21]報道了桿狀病毒將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉移到椎間盤上的實驗研究，結果顯示均在兔椎間盤細胞中成功表達，且無任何癥狀。盡管相關研究數量特別少，但這些結果表明桿狀病毒也有潛力成為一個有效治療IDD的載體工具。

2 非病毒介導的基因治療

2.1 陽離子多聚物載體 陽離子多聚物可與富含陰離子的DNA 互相結合,其形成的復合物(polyplex)具有黏合到細胞膜表面的硫酸粘多糖上的功能,從而利用細胞膜內吞功能將其吞入進入細胞內。報道的陽離子多聚物種類眾多,其中研究較早的是多聚賴氨酸,后來研究發現聚乙烯亞胺性能更佳,是目前研究的熱點[22-23]。2015 年，Feng 等[24]采用陽離子嵌段共聚物用傳遞治療質粒DNA(pDNA)，結果發現，這種混合膠束對核酸酶的高耐受性和對蛋白質吸附的強抵抗力，在大鼠尾盤注射明顯降低了實驗誘導的炎癥反應，增加了糖胺聚糖(GAG)含量，最終獲得了更好的治療效果。2018年，Feng等[25]又報道了一種持續的兩階段生物反應的microRNA 轉運系統，通過可注射的可降解水凝膠包裹基質金屬蛋白酶-響應性多聚膠團進入椎間盤髓核細胞。該研究中陽離子嵌段共聚物被設計成復合miR-29a，第一階段，局部纖維化區域基質金屬蛋白酶水平升高觸發水凝膠降解，從而定位病變椎間盤組織中多聚膠團的持續釋放。第二階段，釋放的多聚膠團對基質金屬蛋白酶反應，使PEG 殼脫落，隨后，在椎間盤髓核細胞中可實現增強細胞攝取和內小體逃逸。多聚膠束是重要的非病毒載體，也是有希望治療IVD 退變的基因治療載體之一。如何找到性能更優的陽離子多聚物并形成有效的載體系統是該方向研究的關鍵點。

2.2 納米顆粒載體 納米顆粒載體所介導的基因治療具有自身獨特的優勢。首先，納米材料的大小在一定的數量范圍內,因此對細胞的生長和活性幾乎不具備細胞毒性；其次，納米顆粒載體通常沒有免疫原性,不會激活細胞的免疫反應；再次,納米顆粒載體對外源基因轉導效率通常要高于脂質體,并且它的自身體積很小,從而可以隨血液循環到達各個組織中。目前實驗研究較多的包括無機納米顆粒(如碳酸鈣、金納米顆粒、磁性氧化鐵)、有機硅納米顆粒、天然高分子納米顆粒等[22]。2010 年，Yang等[26]將BMPF 做成納米顆粒的水懸浮液，實驗發現這些納米顆粒可下調基質蛋白aggrecan、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的基因表達，上調基質金屬蛋白酶3的基因表達。最近研究[27]證明miR-141是IDD 的關鍵調控因子，而納米顆粒轉染miR-141 可加重或減輕實驗性IDD。該研究揭示了miR-141 通過與SIRT1/NF-KB 通路相互作用促進IDD 進展的一種新機制。因此，在體內阻斷miR-141 可能是治療IDD 的一種潛在的治療方法。目前，納米材料研究的蓬勃發展，為下一步基因治療奠定了更加堅實的基礎。

2.3 RNA 干擾 RNA 干擾（RNAi）是由長度為20～30 nt 小雙鏈RNA 介導的轉錄后的基因沉默現象，用于特異性基因沉默，當然也可以用作基因治療。經典的siRNA 介導的RNAi 途徑通過與靶標mRNA互補配對實現對同源序列表達水平的下調。siR‐NA 介導的RNAi 的優勢之一是其有效性。即使是相對較小的siRNA 也能有效地下調特定基因表達的調控。因為siRNA 被納入RNA 誘導的沉默復合體(RISC),它在細胞中是穩定存在[28]，并反復劈開目標mRNA。Kakutani 等[29]首次證明靶向外源性報告基因的siRNA 可以有效地在體外沉默人類和大鼠椎間盤髓核細胞中的基因表達。該研究siRNA介導的基因沉默在大鼠和人椎間盤細胞的體外實驗中是可行的，并且可以有效的下調特定基因的表達。2011 年，Sudo 等[30]發現采用SiRNA 技術，在兔椎間盤細胞中敲除caspase 3 可有效防止凋亡細胞死亡，從而調控IDD。韓敦富等[31]用陰性對照FassiRNA 轉染原代大鼠腰椎間盤細胞后，結果發現siRNA 可降低大鼠椎間盤細胞對IL-β 預刺激導致的凋亡敏感性，說明減輕或抑制炎癥反應對減緩IDD 有重要作用。RNA 干擾能夠特異的沉默一些特定的基因表達，從而影響髓核細胞內相關信號通路作用或細胞因子生成，因此，其在IDD 治療中的應用正變得越來越廣泛。

3 基因編輯技術

基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術[32]。基于DNA 核酸酶的基因編輯技術發展迅速，從第一代DNA 核酸酶編輯系統ZFNs、第二代TALENs 到第三代CRISPR/Cas9 系統，基因編輯效率不斷提高、成本逐漸降低，應用范圍不斷擴大。CRISPR 技術在活的真核細胞中實現了精確高效的基因組編輯[32-33]。在IDD 的基因治療領域，Farhang等[34]報道了將慢病毒CRISPR 表觀基因組編輯系統引入人類退變椎間盤細胞，下調TNF 受體1(TN‐FR1)/IL-1受體1(IL-1R1)的表達。這些研究結果證明了CRISPR-Cas9 系統在病理椎間盤細胞中的有效性和可行性，同時也揭示了IL-1R1表觀基因組靶向性的局限性，這表明可能需要一種定制的方法來成功調控每個基因。Bowles 和Farhang 團隊[35]最近又報道了一種通過dCas9-VPP CRISPR 基因激活系統直接上調主要軟骨組織蛋白aggrecan(ACAN)和Ⅱ型膠原(COL2A1)來增強再生表型的新方法，這種方法表明dCas9-VPR 系統可以在不需要生長因子的情況下穩定地上調COL2A1和ACAN沉積，為IDD 進行基因治療提供了一種新的、精確的控制干細胞表型的方法。基因編輯是一項新的熱門技術，尤其是最新的CRISPR技術在真核細胞中實現了精確高效的基因組編輯，其定點修飾功能必定在IDD的基因治療中開拓出一片新的空間。

4 IDD的基因治療的展望與挑戰

椎間盤是一個低氧并營養供應有限的組織，其獨特的解剖和生理特性是我們進行退變椎間盤基因治療最主要的挑戰之一[36]。盡管現階段一些基因治療應用已初見成效,而且新的基因治療技術的興起讓IDD 的治療再一次步入了全新的起點，但是目前仍然還有許多障礙需要克服，如安全性、高成本和轉染效果等。因此，努力提高基因治療的安全性和有效性是科研工作者們的重要工作，而發展和尋求更高效的基因治療方法,是促進基因治療發展的助推器。