一種基于母血漿的新型冠狀病毒核酸檢測體系的建立

林彭思遠，楊 旭，周世豪，卜秀芬，劉激揚，賀 駿

2019 年12 月始發的由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Related Coronavirus 2,SARS-CoV-2）導致的新型冠狀病毒肺炎（Corona‐virus Disease 2019,COVID-19）已成為全球突發公共衛生事件。SARS-CoV-2 隸屬于β-冠狀病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA 病毒，是迄今為止已發現的可以感染人類的第七種冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）一樣均可引起下呼吸道感染[1]。SARS-CoV 和MERS-CoV 感染的患者在過去20 年里全球累計報道已達1 萬余例。相比SARSCoV 和MERS-CoV，SARS-CoV-2 具有更強的傳染性，迄今為止全球已報道確診患者超1 億，主要傳播途徑為經呼吸道飛沫和密切接觸。孕產婦是冠狀病毒的易感人群，已有報道顯示孕婦感染SARSCoV 的病死率為25%（普通人群10%），而孕婦感染MERS-CoV的病死率高達37%[2]。

現階段COVID-19 診斷的首選方法是采集呼吸道標本，采用基于反轉錄的實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術對SARS-CoV-2 核酸進行檢測，除呼吸道樣本外，糞便、尿液、血液等多種類型標本中均可檢測到SARS-CoV-2 核酸，國內外亦有多項針對血液樣本診斷COVID-19的研究報道[3-4]。本研究開發了一種基于胎兒非整倍體無創產前檢測（Non-Invasive Prenatal Testing，NIPT）的SARS-CoV-2 核酸檢測技術（NIPT-SARS-CoV-2），以期在孕婦進行常規NIPT 檢測的同時僅通過一管外周血實現孕婦這一易感人群的SARS-CoV-2篩查。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 選取2020 年7 月1 日-2020 年9 月30日在長沙市婦幼保健院就診行NIPT檢測的孕婦50 例，其中40 例NIPT 檢測正常，10 例NIPT 檢測為21、18或13三體。所有孕婦均已簽署知情同意書。采集孕婦外周血10 mL，進行血漿分離，分離后的血漿編號立即放入-80 ℃冰箱中保存。將每份血漿平均分成兩份，其中一份用于抽提血漿中游離DNA（cell free DNA，cfDNA），另一份用于提取SARS-CoV-2 RNA。從長沙市第一醫院收集COV‐ID-19患者的SARS-CoV-2核酸標本，并簽署知情同意書。所有標本均在滅活后按三級生物防護要求進行核酸抽提并逆轉錄儲存。

1.2 cfDNA 提取 采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen 公司）提取血漿中的游離DNA，然后采用qubit 核酸定量儀（美國Thermo 公司）進行定量。提取完成的cfDNA 編號后保存于-20 ℃冰箱中。

1.3 SARS-CoV-2 RNA提取與逆轉錄 采用QIAamp?Viral RNA Mini Kit（德國Qiagen 公司）提取血漿中的RNA，提取完成后采用Fapon RNA-seq cDNA Synthesis Kit（菲鵬生物股份有限公司）對提取的RNA進行逆轉錄。

1.4 文庫制備 文庫制備的原始模板通過將孕婦血漿cfDNA 和RNA 逆轉錄產物等比例混合而成。文庫分為三組，正常孕婦組、三體孕婦組和模擬SARS-CoV-2 孕婦組，其中正常孕婦組10 例，由正常孕婦血漿cfDNA 和RNA 逆轉錄產物混合；三體孕婦組10 例，由NIPT 檢測為21、18 或13 三體的孕婦血漿cfDNA 及其RNA 逆轉錄產物混合；模擬SARS-CoV-2 孕婦組30 例，由正常孕婦血漿cfDNA和COVID-19 患者RNA 逆轉錄產物混合，同時設置三個不同的病毒濃度梯度：1 400 拷貝/mL，14 000拷貝/mL，140 000拷貝/mL（分別將1 000拷貝病毒、10 000 拷貝病毒和100 000 拷貝病毒加入至700 uL正常孕婦血漿中，混勻后再進行cfDNA 提取和SARS-CoV-2 逆轉錄），每個濃度梯度各10 例。隨后通過末端修復、加接頭、PCR擴增、定量等步驟進行各組文庫的構建。

1.5 高通量測序與數據分析 所有文庫定量后采用DR8600 測序儀進行高通量測序，下機數據去除低質量序列后獲得高質量序列，將其與人類參考基因組（hg19）進行比對，獲得的BAM文件進行排序后去除PCR重復序列。使用自有NIPT分析軟件進行分析，獲取21 號染色體、18 號染色體、13 號染色體的Z值，從而判斷是否存在21、18、13染色體三體。

與此同時，將下機后獲得的高質量序列與新型冠狀病毒參考基因組（NC_045512.2）進行比對，去除低比對質量的序列（比對長度不足60），統計新型冠狀病毒序列數，從而判斷待檢樣本中是否存在SARS-CoV-2。

1.6 統計學方法 不同方法產生的數據量比較使用配對t檢驗，數據相關性采用皮爾遜相關系數。配對t檢驗、皮爾遜相關系數和離散系數均使用R 3.5.1進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎兒染色體非整倍體檢測評估 對正常孕婦組和三體孕婦組的高通量測序數據進行NIPT分析，發現正常孕婦組10例均為陰性，三體孕婦組4例為21三體、4 例為18 三體、1 例為13 三體、1 例為21 三體合并13三體，表1。在長沙市婦幼保健院臨床常規NIPT 檢測的樣本中隨機挑選20 例樣本，與本研究中的正常孕婦組和三體孕婦組的數據量進行對比分析，發現臨床常規NIPT樣本與本研究組中的樣本檢測數據量差異無統計學意義（圖1，P>0.05）。

圖1 臨床常規NIPT樣本與本研究組樣本數據量對比

表1 胎兒染色體非整倍分析

2.2 孕婦SARS-CoV-2核酸檢測評估 對正常孕婦組和模擬SARS-CoV-2 孕婦組同時進行NIPT 分析和SARS-CoV-2 分析，結果顯示,模擬SARS-CoV-2孕婦組的三個濃度梯度均可檢測到SARS-CoV-2核酸序列，且該組所有樣本NIPT結果均為陰性，表2，正常孕婦組的NIPT 檢測和SARS-CoV-2 檢測均為陰性。

表2 模擬SARS-CoV-2孕婦組SARS-CoV-2檢測及NIPT檢測

2.3 檢測序列數與新型冠狀病毒拷貝數相關性分析 為驗證該檢測方法是否具有用于SARS-CoV-2定量分析的潛力，本研究進一步分析了SARS-CoV-2序列數占比與SARS-CoV-2拷貝數的關系。研究發現，隨著SARS-CoV-2拷貝數的減少，病毒序列數的離散系數也隨之變大（100 000拷貝組：0.107，10 000拷貝組：0.177，1 000拷貝組：0.522）。隨后進一步分析了SARS-CoV-2 序列占比與病毒拷貝數的關系，發現相關系數達到0.977，提示該方法有潛力用于新型冠狀病毒的定量或半定量分析，圖2。

圖2 新型冠狀病毒序列數與拷貝數的關系

3 討論

自COVID-19 爆發以來，陸續有無癥狀感染者報道出來，國家衛健委首次針對這類人群公布的數據顯示，截至2020 年4 月14 日，全國累計發現無癥狀感染者6 764 例[5]。美國疾病控制與預防中心估計，已感染SARS-CoV-2人群中，約35%將不出現癥狀，且病毒傳播往往發生于癥狀出現之前[6]。目前研究顯示，無癥狀感染者存在傳染性，且其病毒載量與COVID-19 患者相似，極有可能成為傳染源造成聚集性疫情發生[7-9]。孕產婦是SARS-CoV-2的易感人群，有資料顯示感染SARS-CoV-2 的孕婦更易出現并發癥[2,10]。美國紐約的一項針對入院待產孕產婦的研究中顯示，33 例SARS-CoV-2 檢測陽性的孕婦中有高達29 例（87.9%）在入院時并未表現出COVID-19的任何癥狀[11]，另一項針對連續入院分娩的675 名孕產婦的研究顯示，10.4%的孕婦SARSCoV-2 核酸檢測為陽性，其中78.6%的孕婦未表現出相應癥狀[10]。因此，對孕產婦這一易感人群實施全面篩查，盡早發現無癥狀的孕產婦SARS-CoV-2感染者將有利于其得到最優化的管理和救治。

NIPT 是一項用于準確判斷孕期胎兒是否罹患染色體非整倍體綜合征的產前篩查技術，已在臨床廣泛推廣應用。本研究通過對常規NIPT 方法進行優化改良后開發的NIPT-SARS-CoV-2技術，僅采集一份外周血標本即同時實現NIPT 檢測和孕婦SARS-CoV-2核酸檢測，達到不額外增加產檢項目即實現孕婦群體SARS-CoV-2無癥狀感染者篩查的目的，從而對SARS-CoV-2 陽性孕婦提前采取干預措施，避免造成潛在的COVID-19 爆發流行。本方法在不增加常規NIPT測序數據量前提下，可以準確的對胎兒染色體非整倍體進行分析，并且可以實現病毒載量為1 400拷貝/mL的SARS-CoV-2核酸檢測。

采集呼吸道標本，尤其是肺泡灌洗液等下呼吸道標本診斷COVID-19 的陽性率最高，除呼吸道樣本外，糞便、尿液、血液等多種類型標本中亦可檢測到SARS-CoV-2 核酸。有研究表明COVID-19 患者發病2～3 d 后即可在血液中檢測到SARS-CoV-2 核酸[12]，甚至有血液標本SARS-CoV-2 核酸檢測陽性，但咽拭子檢測陰性的病例報道[13]，提示通過血液標本進行SARS-CoV-2 核酸檢測是具有可行性的，且有其必要性。人體在病毒感染后，病毒入血形成病毒血癥需要一段時間，但病毒死亡和降解的核酸片段極易進入外周血液，本研究結合NIPT具有高通量和高靈敏度的方法進行外周血中SARS-CoV-2核酸的檢測，可以在感染早期發現病毒核酸片段，具有早期篩查出SARS-CoV-2攜帶者的優勢。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）是國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中優先推薦采用的用于COVID-19診斷的方法，該方法可高效、快速完成病毒核酸檢測，具有靈敏度高和特異性高的特點。現已注冊臨床使用的檢測試劑盒多以病毒基因組中3 段保守基因序列為檢測對象實現SARS-CoV-2 的核酸檢測，但不同試劑盒的檢測性能存在較大差異[14]，假陰性結果常常出現，從而需要待檢者反復多次檢測，但多次復檢仍不能解決病毒變異導致引物和探針不能有效結合而引起的假陰性。最近瑞典報道的宮內感染病例中發現母親和新生兒感染了同一種病毒，但幾天后新生兒體內病毒發生了變異，研究者認為可能與其出生后接觸外部環境所引起的，病毒變異之快令人驚訝[15]，這也提示對病毒進行基因測序的重要性，以避免由于病毒變異引起核酸檢測的假陰性，從而導致不合理的臨床處置。本研究開發的NIPTSARS-CoV-2 技術是對病毒的全基因組進行低深度測序，不光可以實現是否感染SARS-CoV-2的檢測，理論上還可以發現病毒變異，阻止變異病毒的流行，降低其造成爆發流行的潛在風險。

綜上所述，本研究開發的NIPT-SARS-CoV-2 技術可以在孕婦常規產檢過程中，采集一管外周血即達到NIPT 檢測和孕婦SARS-CoV-2 核酸檢測的目的，實現孕產婦這一易感人群的SARS-CoV-2 全面篩查，保證孕婦和新生兒得到最優化的管理與救治。與此同時還有潛力用于病毒變異監測，動態跟蹤病毒的變異情況，最大限度阻止變異病毒的傳播。