tRNA來源的小RNA（tRF）的生物學功能及在癌癥中的作用

許琳楓，王顯儀，柴彬淑，馬中良

轉運RNA（tRNA）是普遍存在的核酸，占整個細胞RNA的4%～10%。在體內主要存在3種核酸，即信使RNA（mRNA）、轉運RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）。由中心法則可知，遺傳信息是從DNA 傳遞給mRNA，然后通過翻譯過程傳遞給蛋白質。tRNA將氨基酸運送至核糖體，從而將mRNA模板中的遺傳信息翻譯成相應的多肽鏈。原先認為tRNA在完成其轉運使命后便發生降解，然而，越來越多的研究表明，來源于tRNA 的小片段RNA（tRNA-de‐rived Fragments，tRFs）不僅是在tRNA二級結構的不同位點進行切割而得的產物，而且還是病理以及生理過程中具有調節性的重要的非編碼RNA。

1 tRF的形成與分類

tRF 起初在原核生物中被發現，之后也發現其廣泛存在于真核生物哺乳動物中，并且與應激反應有關，比如在低氧、氧化、病毒侵染等應激情況下，可能會產生更多的tRF[1]。另外，由于tRF 的序列長度與微小RNA（microRNA，miRNA)十分相似，所以在非編碼RNA 研究的早期階段，研究某些tRF（如tRF-1280、ts-53、ts-101 等）時，常將其當做miRNA做進一步探究。

對于tRF 的命名，有些是根據其發現或發表的時間順序來命名，例如tRF-3006；此外，像tRNA‐Gly-GCC 這個tRF的命名由來是mRNA 上的密碼子與tRNA 上的反密碼GCC 配對，識別出tRNA 所攜帶的氨基酸Gly。

1.1 tRFs 主要種類 tRF 主要有3 種，包括tRF-5，tRF-3 和tRF-1。tRF-5 和tRF-3分別來源于成熟tRNA 的5′端和3′端，所以又稱為5′tRF 和3′tRF。tRF-5 是由Dicer 酶在D 環和反密碼子環之間的不同位置切割產生，根據切割位點的不同，tRF-5可分為3種亞型：tRF-5a（最短）、tRF-5b和tRF5c（最長）。先前有研究表明tRF-5 和tRF-3 是靠Dicer 切割產生，然而，最近有研究者發現，tRF-5 和tRF-3 可能不是只由Dicer切割，還有別的物質參與切割過程。tRF-3 是由血管生成素(Angiogenin，ANG)、Dicer 或核酸外切酶在TψC 環切割產生的，根據在T 環上切割位點的不同，tRF-3分為tRF-3a和tRF-3b。此外，在tRF-3的尾部，有一個“CCA”三核苷酸序列，在3′端經過RNA 酶Z(RNaseZ)切割，形成的tRF 稱為3′CCA tRF。tRF-1 來源于前體tRNA 的3’UTR 區域（非翻譯區），又稱3‘U-tRF，它是由具有PolyU 序列的RNA酶Z（RNaseZ）切割產生的[2]。

除了主要的3 種tRF 外，還有tRF-2 和i-tRF。tRF-2 是在缺氧條件下，tRNA 的反密碼子環發生分解產生的。i-tRF與上述類型的tRF不同，主要來自成熟的tRNA 內部區域（除了5′末端和3′末端以外的區域）。有趣的是，i-tRF 的命名是根據tRNA 中5‘末端的起始位置。A-tRF、V-tRF 和D-tRF 分別是從反密碼子環、可變區以及D 環上切割產生的片段[3]。

1.2 tRNA 半分子 tRNA 半分子（tRNA Halves，tiRNAs）是與tRNA 相關的另一種小片段RNA。應激誘導反應下，刺激血管生成素促進tRNA裂解，從而產生tiRNA。它是由血管生成素從成熟tRNA 的反密碼子環上的不同位點切割生成，長度大致為tRNA 的一半30-40 nt。同樣依據切割位點的不同，包含5′序列以及反密碼子環的稱為5′tiRNA，而含有3′序列和反密碼子環的稱為3′tiRNA[4]。

目前，根據大數據的分析發現tRF 的種類越來越多，Yao等[5]已開發出tRF 的在線數據庫資源——OncotRF（http://bioinformatics.zju.edu.cn/OncotRF），它是識別診斷和預后生物標志物、開發癌癥治療靶點和研究癌癥發病機制的寶貴資源庫。MINTbase(http://cm.jefferson.edu/MINTbase/)是一個含有多種人體組織中發現的tRF 的數據庫，可從中獲取有關tRF 的最大豐度和數據信息；此外還能夠生成各種癌癥類型的tRF的相對豐度圖并將其轉換為數字形式表示[6]。上述兩個數據庫為將tRF 用于癌癥的臨床診斷、預后以及進一步的研究提供了科學依據。

2 tRF的生物學功能以及作用機制

tRF 和tiRNA 通過多種機制發揮生物學作用，包括抑制翻譯過程、調節基因表達、調控細胞周期等，此外，Torres 等[7]發現tRNA 基因的差異表達會導致tRF 的豐度發生變化，而不是成熟tRNA 的豐度改變。

2.1 抑制翻譯過程 tRF 和tiRNA 以多種方式抑制翻譯。比如tRF 和tiRNA 可以通過影響核糖體的形成來抑制蛋白質翻譯起始[8]。tiRNA（主要是5′tiRNA）可以使翻譯速度降低10%～15%。由于tRNA 是蛋白質生物合成的關鍵分子，所以tRNA 破壞可能導致翻譯受到抑制。研究表明，某些特定的tiRNAs 可以組裝成G-四鏈結構(G4-Motif)，它能夠競爭性地與翻譯起始復合體中的eIF4G/eIF4A/eIF4E結合，形成的復合物位于mRNA帽子結構上，從而抑制mRNA 翻譯[9]。Lee 等[10]研究發現，由tRF-3、Argonaute 3（Ago3）和Argonaute 4（Ago4）結合形成的沉默復合物，直接結合靶基因的mRNA，使其進入特定的細胞質加工體，并帶有大量的mRNA降解酶，最終通過降解靶基因的mRNA來抑制靶基因的翻譯。

2.2 調節基因表達 tRF 和tiRNA 參與調節基因表達。Kumar 等發現，一些tRF 優先與Ago 蛋白家族結合，并且Ago 和Dicer 是參與RNA 干擾過程中基因沉默調控的重要因子。Choi 等研究發現來源于成熟tRNA5′端的tRNAGlu-CTC 在Ago1 和Ago4 作用下發揮基因沉默功能。Torres 等發現，近一半的人類tRNA 基因表達沉默或低表達。在HIV-1 感染的細胞中發現了來源于tRNALys 的tRF-3006，并且具有高豐度。另外，tRF-3006 使報告基因沉默并與Dicer和Ago2結合，促使了抑制HIV[11]。

tRF-1、tRF-3 和tRF-5 可能通過與Piwi 蛋白或Ago 蛋白相互作用來調節基因表達，從而影響基因的沉默。在胚胎干細胞和胚胎中，來源于tRNAGly-GCC 的tRF-5 抑制內源性反轉錄相關基因的表達。Piwi 蛋白Twi12 與tRF-3 相互作用形成tRF-3-Twi12復合物，該復合物與Xrn2和Tan1協同作用，共同調節rRNA的加工過程[12]。

2.3 調節細胞周期 tRF 和tiRNA 通過參與細胞周期過程來調節細胞增殖。敲低tRF-1001 可以干擾細胞增殖，將細胞停滯在G2 期，并抑制DNA 的生物合成[13]。

tRF 還可通過與細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)結合防止細胞凋亡。先前有研究表明，成熟的tRNA 分子可以與Cyt C 結合，抑制細胞凋亡體的形成和caspase 9的活性，從而促進細胞存活。在高滲透壓條件下，部分tRF 在血管生成素作用下可以與線粒體釋放的Cyt C 形成核糖核蛋白復合體，從而抑制細胞凋亡體的形成和活性[14]。由此可見，tRF與Cyt C 之間相互作用引發一系列生物學過程，導致細胞凋亡受到抑制，這漸漸被認為是一種新的抗細胞凋亡機制。

3 tRF在癌癥中的研究進展

3.1 tRF 與癌癥相關信號通路 tRF 可以通過調控癌基因或抑癌基因的表達，參與癌癥相關的信號通路，從而影響一系列與癌癥發生，發展相關的生物學過程。并且tRF 在多種惡性腫瘤細胞中具有功能活性[15]。

在結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)中，tR‐NALeu 和tRF/miR-1280 通過抑制可維持腫瘤干細胞類似細胞功能的Notch 信號通路，從而抑制CRC的生長和轉移。Wang 等研究發現，由于上皮細胞凋亡和過氧化物酶增殖物激活受體信號通路，導致發生負反饋調節，所以tiRNATyr-GTA 在CRC 中具有作為治療靶點的潛能。在大腸癌中，一些tRF 主要作用于含維生素的代謝途徑和環鳥嘌呤一磷酸/蛋白激酶G信號通路，并且它們的靶點是部分差異表達的mRNAs[2]。此外，癌基因AURKA 通過調節Wnt/β-catenin 和PI3K/AKT 信號通路使組蛋白甲基化，從而誘導上皮向間質轉化，所以AURKA 可作為胃癌治療的潛在靶點。另外，由tRNAGlu，tRNAAla，tRNAAsp 和tRNATyr衍生的一類新的tRFs，通過取代YBX1中的3‘-UTR來抑制乳腺癌細胞中多個致癌基因轉錄本的穩定性，對癌癥產生抑制作用。這里的YBX1 是一種多功能的RNA 結合蛋白，參與多種細胞信號轉導途徑，在多種癌癥中過表達[16]。由此可見，許多信號通路的調節與人類癌癥疾病密切相關。

3.2 診斷及預后的生物標志物 tRF在癌癥中的異常表達引起了廣泛關注，我們通過一些技術如基因組測序等探索到tRF 作為生物標志物在臨床中的應用。盡管tRF 作為生物標志物的研究仍處于初步階段，但已有一些新的研究進展。

在非小細胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）患者血清樣本中，tRFLeu-CAG 表達水平較高，并且在IV 期患者樣本中的表達最顯著，，所以tRFLeu-CAG 可以作為NSCLC 診斷的生物標志物[17]。Ana 等檢測到了來自5’端的tRNAVal-CAC，tRNAGlu-CTC在大腸癌中表達水平較高，由此認為tRNAVal-CAC 和tRNAGlu-CTC 有可能成為診斷大腸癌的生物標記。Mo等發現5‘tiRNAVal通過抑制Wnt信號通路而成為一種新的腫瘤抑制因子，其可能成為乳腺癌的潛在診斷生物標志物。Michael 等研究發現，tRNALys-CTT 和tRNAPhe-GAA 在前列腺癌的不同分期中存在差異表達，并且來源于tRNALys-CTT 的tRF-315 以及來源于tRNAPhe-GAA 的tRF-544，它們在前列腺癌中的表達水平分別上調和下調，所以，它們可能成為評估前列腺癌病情和預后的潛在生物標志物。此外，來源于tRNA 內部區域的tRNAGly-CCC是慢性淋巴細胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL）預后不良的潛在生物標志物，還可用于篩查CLL。tRF-5s也可用于檢測牛白血病病毒(Bovine Leukemia Vi‐rus，BLV)的情況。在腎透明細胞癌中，tRFVal-AAC的表達水平與腫瘤分期有關，在Ⅲ/Ⅳ期時，tRFVal-AAC表達水平顯著降低，因此有望成為癌癥診斷標志物。此外，tRF 還可以作為生物標志物來區分乳腺癌中腫瘤衍生的細胞外囊泡[18]。

tRF 也被認為是潛在的非侵入性生物標志物。在非三陰性乳腺癌患者中，tDR-7816、tDR-5334 和tDR-4733 在血清中的豐度低于健康對照組，這些tRF 可用來判斷非三陰性乳腺癌的發生與否。其中，tDR-7816可能通過影響異種代謝過程促進乳腺癌的發生。在急性組織器官損傷過程中，循環系統的tRF 水平升高，使得tRF 在15 個敏感基因中比其他已知的組織損傷標志物更敏感，所以其具有作為識別器官損傷的新標志物的潛力。在腫瘤患者的尿液和血清中也能檢測到tRFs。此外，最新研究表明，來自tRNA5′末端的六個tRF(tRFGlu-CTC-003，tRFGly-CCC-007，tRFGly-CCC-008，tRFLeu-CAA-003，tRFSer-TGA-001，tRFSer-TGA-002) 在早期乳腺癌（Early Breast Cancer，EBC）患者的血漿樣品中表達水平顯著下調，可作為EBC 的新型診斷生物標志物[19]。

因此，tRF 有可能成為癌癥診斷的新的生物標志物，這顯示了其潛在的臨床應用價值，但還需進行深入的評估。表1 為目前已發現的具有生物標志物功能的tRF。

表1 具有生物標志物功能的tRF

3.3 精準治療的靶標 tRF不僅可以發揮生物標志物的功能，而且還具有開發癌癥靶向治療的新可能。在人T 細胞白血病病毒1 型(the Human T-cell Leukemia Virus Type 1，HTLV-1)轉化的細胞中，tRF-3019表達水平較高。其中HTLV-1是一種引起惡性T 細胞白血病的逆轉錄病毒。Ruggero 等[24]發現tRF-3019 能夠啟動HTLV-1 逆轉錄酶，并在病毒中大量存在，所以有可能成為控制HTLV-1 感染的新靶點。

Kim 等的研究發現，抑制3‘端來源的tRFLeu-CAG 導致患者的原位肝癌細胞凋亡。tRFLeu-CAG與至少兩個核糖體蛋白mRNAs 相互作用，以增強蛋白質翻譯。因此，這種抑制減少了核糖體蛋白的翻譯，并導致核糖體亞基減少。例如，RPS28 mRNA 的翻譯減少導致pre-18S核糖體RNA處理受阻，最終抑制了40S 核糖體亞基的產生。這表明tRFLeu-CAG可能成為潛在的癌癥靶標[25]。

此外，還發現tRFLeu-CAG 在非小細胞肺癌中的表達水平升高，Ⅲ、Ⅳ期水平升高顯著，并且抑制tRFLeu-CAG則可抑制AURKA癌基因的表達，即使癌細胞的增殖受到抑制，所以tRFLeu-CAG 有潛力作為治療靶點[17]。分別來自于tRNAGly-GCC-1-1和tRNAGly-GCC-1-2 的tDR-0009 和tDR-7336在三陰性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer，TNBC）中高表達，并且與阿霉素在調節干細胞以及細胞對IL-6的反應中有關[26]。所以tRF 可能在耐藥中也發揮重要作用，值得進一步研究。

3.4 tRF在其他腫瘤中的作用 在B細胞淋巴瘤細胞中，tRF-3027 通過抑制一種內源性單鏈DNA 結合蛋白RPA1來抑制細胞增殖并可調節DNA 損傷。最新有研究發現，來源于前體tRNASer 的tRF-1001，在許多腫瘤細胞系中高表達。敲除tRF-1001 基因可抑制腫瘤細胞增殖以及DNA 生物合成。此外tRF3E 通過核仁素（Nucleolin，NCL）介導的機制在乳腺癌發病機制中發揮重要作用，從而抑制腫瘤發生[27]。

在本實驗室研究中，發現了tRFLeu-CAG 是來源于5'tRNA 的半分子，并且可以促進非小細胞肺癌（NSCLC）的發展，同時在NSCLC 中是高表達的。隨著臨床分期的不同，tRFLeu-CAG 表達呈現上調趨勢。另外還研究發現tRFLeu-CAG 可以在NSCLC 中引起化學藥物抗性和誘導自噬。有趣的是，Veneziano等[28]還發現在CLL中，tRF的表達出現失調情況。目前已確定的tRFs 的類型以及在癌癥中的生物學功能如表2所示。

表2 已證實的tRF的類型以及在癌癥中的作用

4 總結與展望

目前，已經證實了微小RNA（microRNA，miRNA)、環狀RNA（circular RNA，circRNA）以及長鏈非編碼RNA(Long Non-coding RNA，lncRNA)的調節作用，tRF 在轉錄和轉錄后水平表達調控中發揮重要作用[34-36]。

近年來tRF 的研究取得了一些重要進展，其在調控基因表達、蛋白質翻譯等生物學功能方面發揮著不同的作用，并與各種癌癥發展密切相關，既可促進腫瘤發生，也具有抑制癌癥發展的潛力。

隨著精準醫學的興起，tRF 的臨床潛力也引起了廣泛關注。tRF 可被用作診斷性生物標志物，治療靶點和預后性生物標志物。在臨床開發方面，開發新的試劑盒以及研制新型藥物，tRF 因其獨特性可充分發揮重要作用。

tRF 為癌癥的探索和治療提供了新的方向，在該領域的研究中已經取得了許多令人鼓舞的成果，OncotRF 和MINTbase 數據庫的建立已為我們提供了很多便利，但同時對tRF 的研究仍然存在許多挑戰。我們對tRF 的生物發生過程以及分子機制尚不清楚。例如，tRF由血管生成素(ANG)、Dicer或核酸外切酶等多種酶剪切而來，這些酶受到怎樣的信號調控，以及某些和miRNAs 具有相似大小的tRF能否以miRNA 的作用方式發揮作用，依然未知。并且tRF 與其他非編碼RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）之間的作用仍未明確闡述，以及在早期研究中，將tRF 認為是miRNA，二者間的區別與聯系目前尚未清晰。此外，tRF 由tRNA 剪切而來，那么tRF 的出現對tRNA 有怎樣的影響，能否使tRNA 發揮正常的轉運氨基酸作用，在氨基酸代謝中是否發揮重要角色，依然值得探究。在臨床應用時，tRF有可能會造成耐藥性，耐藥問題的解決還有待進一步研究。此外，與tRF 相關的蛋白質、作用的靶基因以及調控的信號通路還有待進一步豐富。并且我們需要更精確和智能的檢測分析技術來提高研究效率，以實現對tRF 作用機制的探索和臨床應用的可能性。

總而言之，在未來臨床醫學上，tRF 在腫瘤治療方面具有巨大的應用潛力，這為我們抗擊癌癥提供了新手段。