右美托咪定對七氟醚致老年小鼠腦組織炎性反應的影響

湯娜娜，李 娟，李 軍，曹福羊

術后認知功能障礙是圍手術期常見并發癥，可表現為患者記憶力、注意力或執行能力的改變[1]。研究表明全身麻醉與術后神經系統功能障礙存在相關聯系[2]。七氟醚是一種常用的全身麻醉劑，可誘導神經系統炎性反應和凋亡，這些病理生理反應均與認知功能障礙的發生密切相關[3-4]。右美托咪定是一種效果確切的麻醉輔助用藥，其具有鎮靜、抑制交感活性、抗炎、抗凋亡和抗神經興奮毒性等優點[5-6]。有研究證實，右美托咪定可抑制多種因素導致的腦組織炎性反應，如膿毒癥導致大鼠腦組織炎性反應[7]、大鼠全腦缺血再灌注損傷導致的炎性反應[8]、高氧導致的新生大鼠腦損傷等[9]。但是關于右美托咪定對七氟醚導致的腦組織炎性反應的直接作用少有報道。因此本研究擬探討右美托咪定預處理對七氟醚吸入麻醉后的老年小鼠腦組織炎性反應的影響。

1 材料與方法

C57BL/6J 雄性小鼠共126 只，12 月齡，由北京華阜康生物工程有限公司提供。采用隨機數字表法分為3 組：對照組（Con 組）、七氟醚組（Sevo 組）、七氟醚+右美托咪定組（Sevo+Dex 組）。將小鼠置于標準飼養環境（室溫18～22℃，自然晝夜光線照明），自由進食進水。

1.1 模型制備及治療 Sevo+Dex 組小鼠在吸入七氟醚前30 min腹腔緩慢注射右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）25 ug/kg，而Con 組和Sevo 組小鼠腹腔注射同等容量生理鹽水作為對照。Sevo 組和Sevo+Dex 組小鼠置自制密閉樹脂盒麻醉處理2 h，通過氣體流量計將3%七氟醚和33% O2混合加濕后從入氣口輸入樹脂箱內，麻醉氣體監測儀（德爾格醫療設備有限公司，德國）監測七氟醚及O2濃度。應用小鼠遙測系統對小鼠血壓、脈氧、心電進行實時監測。Con 組小鼠則置于相同環境，連續吸入33%O22 h。

1.2 伊文氏藍和腦組織含水量的測定 于造模后6、12和24 h時，每組取6只小鼠，尾靜脈注射2%伊文氏藍(Evan's Blue，EB，美國Sigma 公司)3 mL/kg，2 h后麻醉小鼠，于左心室灌注等滲生理鹽水，至右心耳流出清亮液體，斷頭取腦，取左側皮層組織稱重，放入盛有3 mL 甲酰胺的離心管，37 ℃水浴48 h，3000×g 離心15 min，取上清液。采用分光光度計波長632 nm 處檢測其吸光度。根據標準曲線計算腦組織EB 含量。取右側皮層組織，濾紙吸干多余水分，稱濕重，放入烘箱內烘烤（80℃，48 h）至恒重，取出后稱干重，計算腦組織含水量，即腦組織含水量=[(濕重－干重)/濕重×100%]。

1.3 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測TNF-α 和HMGB1的水平 于造模后6、12和24 h時，各組取6只小鼠，麻醉后處死小鼠，經左心室灌注等滲生理鹽水，取皮層組織，研磨勻漿后，4℃下10 000×g離心10 min，取上清液。采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒（ELISA）法（美國R＆D 公司）檢測腦組織TNF-α和高遷移率族蛋白B1（High Mobility Group Box 1，HMGB1）的水平。

1.4 TUNEL 染色檢測皮層細胞凋亡情況 于造模后24 h 時，各組取6 只小鼠，取腦組織方法同上，10%多聚甲醛固定6 h，制備成石蠟切片。參考TUNEL 凋亡試劑盒進行實驗（瑞士Roche 公司）。在光學顯微鏡下（200 倍）觀察并分析。每個標本隨機選取3 張切片，每個切片取3 個不同視野進行觀察，皮層組織細胞核圓，呈淡藍色，而凋亡細胞的細胞核固縮，呈棕黃色，計算凋亡細胞數及凋亡指數（凋亡細胞數/有核細胞總數×100%）。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0 統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠皮層組織EB 含量和含水量的比較與Con 組比較，造模后6、12 和24 h 時，Sevo 組和Sevo+Dex組小鼠皮層組織EB含量和含水量明顯增加(P<0.05)。與Sevo組比較，造模后6、12和24 h時Sevo+Dex 組皮層組織EB 含量和含水量降低（P<0.05），表1。

表1 各組小鼠造模后6、12和24 h時皮層組織EB含量和含水量的比較（n=6，）

表1 各組小鼠造模后6、12和24 h時皮層組織EB含量和含水量的比較（n=6，）

與Con組比較，*P<0.05 與Sevo組比較，#P<0.05

2.2 各組小鼠皮層組織炎癥因子TNF-α和HMGB1水平的比較 與Con組比較，造模后6、12和24 h時，Sevo 組 和Sevo+Dex組小鼠皮層組織TNF-α 和HMGB1水平明顯增加(P<0.05)。與Sevo組比較，造模后6、12和24 h時Sevo+Dex組皮層組織TNF-α和HMGB1水平明顯降低（P<0.05），表2。

表2 各組小鼠造模后6、12和24 h時腦組織TNF-α和HMGB1的比較（n=6，）

表2 各組小鼠造模后6、12和24 h時腦組織TNF-α和HMGB1的比較（n=6，）

與Con組比較，*P<0.05 與Sevo組比較，#P<0.05

2.3 各組小鼠皮層組織細胞凋亡情況的比較 于造模后24 h，Con 組小鼠皮層可見少量細胞凋亡。與Con 組比較，造模后24 h 時，Sevo 組和Sevo+Dex組小鼠皮層凋亡細胞明顯增多(P<0.05)。與Sevo組比較，造模后24 h 時Sevo+Dex 組皮層組織凋亡細胞明顯減少（P<0.05），圖1，表3。

圖1 各組小鼠皮層細胞凋亡情況的比較

表3 各組小鼠皮層組織細胞凋亡指數的比較（n=6，）

表3 各組小鼠皮層組織細胞凋亡指數的比較（n=6，）

與Con組比較，*P<0.05 與Sevo組比較，#P<0.05

3 討論

研究表明連續吸入3%七氟醚2 h 可導致大鼠認知功能障礙，可能與上調海馬TNF-α、IL-6、IL-8和Caspase-3的表達,激活神經系統炎性通路和凋亡通路有關[9]。因此本實驗采用此方法誘導老年小鼠腦組織產生炎性反應。

目前，術后認知功能障礙發病機制尚不清楚，但是神經炎性機制是最重要的理論之一。炎癥因子和趨化因子（TNF-α、IL-1β、HMGB1）等的合成和釋放，可破壞血腦屏障的通透性，血腦屏障破壞后可使大量有害物質進入中樞神經系統，導致中樞神經系功能障礙，此時EB 便可大量通過血腦屏障進入腦組織[10-11]。本實驗結果顯示，與Con 組比較，Sevo組小鼠造模后6、12和24 h皮層組織EB含量和含水量升高，且24 h 皮層細胞凋亡明顯增多，表明小鼠血腦屏障受到破壞，神經系統產生炎性反應。

右美托咪定是一種高選擇性的α2 腎上腺素能受體激動劑。被廣泛地應用于鎮靜、麻醉性鎮痛、抗焦慮。圍手術期給予右美托咪定治療可顯著降低術后炎性反應和認知功能障礙的發生[12]。研究發現25 ug/kg右美托咪定預處理可明顯改善七氟醚誘導的新生大鼠遠期認知功能障礙[13]。同時，右美托咪定還可通過減少腦組織神經元凋亡來改善阿爾茨海默癥小鼠認知功能障礙[14]。本實驗發現，右美托咪定預處理減少了小鼠吸入七氟醚后，其6、12和24 h 腦組織EB 含量和含水量，且24 h 皮層組織細胞凋亡明顯減少，提示右美托咪定可減輕七氟醚誘導的老年小鼠血腦屏障的破壞，減少細胞凋亡。

大量證據表明吸入麻醉藥與認知功能障礙存在一定的聯系且與激活神經系統炎性反應相關[15]。Chen等[16]研究發現，右美托咪定可改善肝部分切除小鼠術后認知功能障礙，可能與抑制小膠質細胞活化，下調NF-κB通路，降低海馬組織TNF-α和IL-1β的水平有關。本實驗結果表明，老年小鼠吸入3%七氟醚2 h 可顯著增加皮層組織炎癥因子（TNF-α和HMGB1）的水平，提示七氟醚可導致神經系統炎性反應。給予右美托咪定預處理后，Sevo+Dex組小鼠皮層組織炎癥因子（TNF-α 和HMGB1）的水平較Sevo組明顯降低，證明預先給予右美托咪定腹腔注射可減輕因吸入七氟醚導致的神經系統炎癥。

綜上所述，右美托咪定可減輕七氟醚誘導的老年小鼠神經系統炎癥和血腦屏障的破壞、腦組織細胞凋亡。為將來進一步研究右美托咪定是否能減輕吸入麻醉藥導致的認知功能障礙及其作用機制奠定了基礎。