驅動蛋白家族成員2A與結直腸癌臨床特征/預后的關聯及其對癌細胞增殖/侵襲的調控作用

吳 煒，李延宏

結直腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，近年來隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，其發病率在我國呈逐漸上升趨勢[1]。目前，結直腸癌根治性治療方法仍首選外科切除，然而由于大部分患者發病早期一般無明顯癥狀，超過75%的患者在確診時錯過了根治性手術切除的最佳時機，導致預后不良[2-4]。因此研究結直腸癌的惡性生物學機制，尋找結直腸癌患者預后潛在生物標志物，可為結直腸癌患者預后評估、監測提供一定科學依據[5-7]。驅動蛋白家族成員2A（Kinesin family 2A，KIF2A）是驅動蛋白-13 家族成員之一，作為一種非動能微管解聚酶，參與了雙極紡錘體的組裝，染色體分離，以及細胞有絲分裂的過程[8-9]。近年來，有研究發現，KIF2A 參與包括卵巢癌、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等一系列惡性腫瘤的發生與進展，并與抗腫瘤藥物耐藥的風險存在著重要關聯[10-14]。然而目前有關KIF2A 在結直腸癌中的作用罕見研究報道。因此，本研究通過檢測KIF2A在結直腸癌組織、癌旁組織中的表達情況，旨在探究KIF2A與結直腸癌患者的臨床病理特征及其生存預后的相關性，此外，并探討敲降KIF2A對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲，以及其下游磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（Phospha‐tidylinositol 3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/AKT）信號通路的影響，希望為臨床治療結直腸癌提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究回顧性分析98 例于2016 年1 月至2019 年12 月在西安國際醫學中心醫院進行手術切除的結直腸癌患者?；颊呒{入標準：①經組織病理學確診為原發性結直腸癌；②年齡18～80歲；③接受手術切除；④術中留存的癌組織和癌旁組織保存完好且可用于免疫組織化學（Immuno‐histochemistry，IHC）檢驗；⑤術前腫瘤特征和術后生存隨訪數據記錄完整。排除標準：①復發或者繼發性結直腸癌；②出現遠端轉移；③有其他腫瘤史或有新輔助治療史的結直腸癌患者。納入患者的平均年齡為（66.3±10.4）歲，其中男性患者64 例（65.3%）、女性患者34 例（34.7%）。病理分級G1患者16 例（16.3%）、G2 患者69 例（70.4%）、G3 患者13例（13.3%）；平均腫瘤直徑（4.5±1.2）cm；淋巴結轉移陰性患者69例（70.4%）、陽性患者29例（29.6%）；T1 期患者3 例（3.1%）、T2 期患者11 例（11.2%）、T3 期患者82 例（83.7%），T4 期患者2 例（2.0%）；N0 期患者67 例（68.4%），N1 期患者19 例（19.4%），N2期患者12例（12.2%）；TNM I期患者14例（14.3%），TNM II期患者53例（54.1%），TNM III期患者31 例（31.6%）。本研究經我院倫理審查委員會批準，且所有患者或其家屬均已簽署知情同意書。

1.2 數據及樣本收集 從電子病歷中收集患者年齡，性別和術前腫瘤特征（病理分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、T 分期、N 分期及TNM 分期）。從生存隨訪數據中獲取患者的生存狀態，并根據患者的生存狀態計算總體生存率（Overall Survival,OS）。所有患者開始隨訪日期為2016年2月，最后隨訪日期為2020年2月29日。OS定義為從患者接受手術至患者死亡的時間。從病理科獲取患者術中切除的癌組織和癌旁組織，且所有組織均采用福爾馬林固定石蠟包埋的方式進行保存。

1.3 主要試劑 人結直腸癌HCT116細胞購自美國模式培養物集存庫；二氨基聯苯胺試劑購自美國安捷倫公司；基質膠購自美國碧迪公司；HlilyMax 試劑盒購自日本同仁化學科技有限公司；蘇木精試劑、Cell counting kit-8（CCK-8）試劑盒購自美國西格瑪奧德里齊公司；逆轉錄試劑盒、SYBR?Green 熒光定量試劑盒均購自日本東洋紡公司；TRIzol 試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液和提取緩沖液、Pierce?BCA 蛋白定量試劑盒、NuPAGE Bis-Tris 預制膠均購自美國賽默飛公司；PVDF 膜購自德國默克公司。一抗包括：KIF2A 兔多克隆抗體、PI3K 兔單克隆抗體、AKT 兔多克隆抗體、pAKT 兔多克隆抗體、內參GAPDH 兔多克隆抗體購自美國艾博抗公司；二抗山羊抗兔IgG（重鏈和輕鏈）抗體購自美國CST公司。

1.4 KIF2A 水平評估 患者癌組織及癌旁組織中KIF2A 的表達水平采用IHC 測定。所有操作均按照標準程序進行，首先將癌組織和癌旁組織標本切成厚度為4 μm 薄片；對組織切片進行脫蠟，復水和表位抗原修復后，采用過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性；隨后用0.025%Triton X-100 TBS 溶液透膜以降低組織切片表面張力，加入10%正常血清室溫封閉2 h 以減少非特異性抗原結合；然后加入稀釋倍數為1:200 的兔抗人KIF2A 抗體4℃條件下孵育過夜；次日加入稀釋倍數為1:5000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體，室溫下孵育1 h；最后加入二氨基聯苯胺顯色10 min，水洗后再加入蘇木精復染，再次水洗后封片。在顯微鏡下觀察IHC 染色結果，并采用半定量評分法對KIF2A 的表達水平進行評估。半定量評分法包括染色強度評分和染色密度評分，其中染色強度評分如下：無染色=0 分，輕度染色=1 分，中度染色=2 分，高度染色=3分；染色密度評分如下：0%=0分，1%-25%=1分，26%～50%=2 分，51%～75%=3 分，76%～100%=4 分；IHC 總分=染色強度評分×染色密度評分（0～12分）[15]。根據IHC染色評分，KIF2A表達水平劃分為高表達（IHC評分＞3）和低表達（IHC評分≤3）[15]。

1.5 細胞培養及轉染 人結直腸癌HCT116細胞用含10%胎牛血清McCoy’s 5A 培養基液于37?C、含5%的CO2的細胞培養箱中培養。構建3 種KIF2A短發夾RNA（Short haircut，shRNA）（抑制KIF2A 表達的小分子化合物）和陰性對照（Negative Control，NC）shRNA質粒，選擇抑制KIF2A表達作用最顯著的一種shRNA，進行之后的研究。當HCT116 培養至融合達到50%～60%時，使用HlilyMax，按照說明書將KIF2A ShRNA 質粒和NC ShRNA 質粒轉染入細胞，并將不做任何處理的細胞、轉染NC ShRNA質粒的細胞以及轉染KIF2A ShRNA 的細胞分別定義為正常對照組（Normal）、陰性對照組（Sh-NC）和KIF2A敲降組（Sh-KIF2A）。

1.6 測定細胞增殖、凋亡能力 用CCK-8增殖試劑盒檢測細胞增殖能力。細胞轉染后，分別在0、24、48、72 h 后加入CCK-8，孵育2 h 后使用酶標儀上機檢測光密度（Optical Density，OD）值，評估細胞增殖能力與細胞凋亡，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，在細胞轉染48 h后按照說明書進行檢測。

1.7 測定細胞遷移和侵襲能力 細胞遷移能力用細胞劃痕實驗檢測，將HCT116 細胞以每孔2×105個細胞的密度接種在六孔板中，細胞轉染24 h并生長至80%～90%匯合后，用移液管尖端垂直孔板并刮擦細胞層劃線。劃線后，用PBS 緩沖液洗滌3次，在不含胎牛血清的培養基中培養24 h 后，使用倒置顯微鏡捕獲劃痕區域的圖像。

細胞侵襲能力用Transwell 實驗檢測，在轉染24 h后，收集細胞，加入不含胎牛血清的培養基，接種于基質膠鋪底的上層小室中，下室加入正常培養基，孵育24 h。將小室上層的貼壁細胞去除，隨后用PBS 洗滌，再用4%甲醛15 min 固定，之后使用結晶紫溶液染色，再用PBS 洗滌，最后顯微鏡下觀察并對下層細胞計數。

1.8 Real-time PCR檢測mRNA表達量 收集轉染48 h 后的細胞，用TRIzol 試劑提取總RNA，然后使用逆轉錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix，以總RNA 為模板逆轉錄合成cDNA，再使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒，按照其說明書進行PCR 反應。KIF2A 前端引物：5’GCCGAATACATCAAGCAAT 3’,后端引物：5’CTCTCCAGGTCAATCTCTT 3’;GAPDH,前端引物5’GACCACAGTCCATGCCATCAC 3’;后端引物：5’ACGCCTGCTTCACCACCTT 3’。

1.9 Western blotting 檢測 使用蛋白裂解液和提取緩沖液提取總蛋白后，使用Pierce?BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量。以（4%～12%）Nu‐PAGE Bis-Tris 預制膠進行電泳后，使用PVDF 膜進行轉膜。與以一定稀釋比例的一抗在4 ?C 條件下孵育過夜后，將PVDF 膜在室溫下與稀釋后的二抗孵育1 h，之后使用Pierce?ECL 發光液在暗室中對膜PVDF 進行曝光并拍照。所用一抗包括：KIF2A兔多克隆抗體（1：1000）、PI3K 兔單克隆抗體（1：1000）、AKT兔多克隆抗體（1：1000）、pAkt兔多克隆抗體（1：1000）、GAPDH 兔多克隆抗體（1：1000）。二抗：山羊抗兔IgG（重鏈和輕鏈）抗體（1:3000）。

1.10 統計學處理 采用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 7.00 進行統計學分析和圖片制作。連續變量以均值±標準差（）表示；分類變量以頻次（百分比）表示。配對樣本組間比較采用McNe‐mar's 檢驗。關聯分析采用Chi-square 檢驗或者Spearman 秩相關分析。OS 采 用Kaplan-Meier 曲 線描述，組間OS 差異采用Log-rank 檢驗比較。OS 的獨立影響因素采用向后逐步多因素Cox 比例風險回歸模型分析。所有檢驗均為雙側檢驗。P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 KIF2A 表達水平在結直腸癌患者癌組織和癌旁組織的比較 癌組織KIF2A 高表達及癌旁組織KIF2A 低表達IHC 染色樣例（圖1）。KIF2A 高表達比例在癌組織中（58.2%）較癌旁組織（33.7%）更高；而KIF2A 低表達比例在癌組織中（41.8%）較癌旁組織（66.3%）更低（χ2=21.925，P<0.001，表1），提示KIF2A 的表達水平在結直腸癌組織中較癌旁組織更高。

表1 癌組織和癌旁組織中KIF2A表達水平的比較

圖1 癌組織和癌旁組織KIF2A表達IHC結果樣例

2.2 癌組織KIF2A 表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關聯分析 癌組織KIF2A 的表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征參數關聯分析顯示，癌組織KIF2A 高表達與較大的腫瘤直徑（r=5.756，P=0.016），淋巴結轉移陽性（r=7.492，P=0.006），較高的N 分期（r=0.246，P=0.014）和TNM 分期（r=0.228，P=0.024）相關（表2），提示在結直腸癌患者中，癌組織中KIF2A高表達與較差的結直腸癌的臨床病理特征相關。

表2 癌組織中KIF2A表達水平與臨床特征的關聯

2.3 癌組織中KIF2A 表達水平與結直腸癌患者預后的關聯分析 KIF2A 高表達的結直腸癌患者OS（平均OS 31.6 月,95%CI：26.3～36.9 月）較KIF2A 低表達的結直腸癌患者OS（平均OS 43.0 月,95%CI：38.6～47.5 月）更短（χ2=7.509，P=0.006,圖2），提示在結直腸癌患者中，癌組織中的KIF2A高表達與較差的預后相關。

圖2 癌組織KIF2A表達水平與OS的關聯（Log-rank 檢驗）

2.4 結直腸癌患者OS 的獨立影響因素分析 進一步采用向后逐步多因素Cox 比例風險回歸模型分析結直腸癌患者中的OS 獨立影響因素分析，結果顯示KIF2A 高表達（HR=3.732，P=0.018）和較高的病理分級（HR=2.601，P=0.020）是較差OS 的獨立影響因素（表3）。

表3 OS的獨立影響因素分析

2.5 轉染后KIF2A 在HCT116 細胞中的表達量水平 KIF2A 敲降組對比陰性對照組，KIF2A mRNA（圖3A）和蛋白（圖3B）表達水平明顯降低（P<0.001），而陰性對照組對比正常對照組，KIF2A mRNA 和蛋白表達水平無差異（P>0.05）。

圖3 轉染后KIF2A的表達量水平

2.6 敲降KIF2A 對HCT116 細胞增殖和凋亡的影響 轉染48 h 以及72 h 后，KIF2A 敲降組相較于陰性對照組，細胞增殖能力均明顯降低（P<0.05），而陰性對照組對比正常對照組細胞增殖能力無差異（P>0.05，圖4A）。流式細胞術檢測結果顯示，KIF2A 敲降組相較于陰性對照組，細胞凋亡明顯升高（P<0.01），而陰性對照組對比正常對照組細胞凋亡無差異（P>0.05，圖4B，4C)。

圖4 敲降KIF2A對細胞增殖和凋亡的影響

2.7 敲降KIF2A 對HCT116 細胞遷移和侵襲的影響 KIF2A 敲降組對比陰性對照組，以及陰性對照組對比正常對照組的細胞遷移能力均無差異（P>0.05，圖5A，5B）。Transwell 實驗檢測結果顯示，KIF2A 敲降組對比陰性對照組的細胞侵襲能力更弱（P<0.01），而陰性對照組對比正常對照組的細胞侵襲能力無差異（P>0.05）（圖5C，5D）。

圖5 敲降KIF2A對細胞遷移和侵襲的影響

2.8 敲降KIF2A 對下游PI3K/AKT 通路蛋白表達水平的影響 KIF2A 敲降組相較于陰性對照組，PI3K、p-AKT 的蛋白表達量更低，而陰性對照組對比正常對照組的PI3K、p-AKT的蛋白表達量無差異（圖6）。

圖6 下游PI3K/AKT通路蛋白表達水平

3 討論

本研究通過分析KIF2A 在結直腸癌患者癌/癌旁組織中的表達，發現在結直腸癌患者中，①KIF2A 的表達水平在癌組織中較癌旁組織更高；②癌組織KIF2A高表達與較差的臨床病理特征相關，并且癌組織KIF2A 高表達是較差生存預后的獨立影響因素；③敲降KIF2A可抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲，促進細胞的凋亡，并抑制PI3K/AKT 信號通路的激活。

驅動蛋白是一類分子馬達超家族蛋白，參與包括：神經元的生長發育、有絲分裂中紡錘體的形成、膜性細胞器的傳輸、微管的動力學控制、信號傳導等一系列微觀生命活動，為各種生命活動所需的物質運輸提供動力[8-9,16]。近年來，有研究發現，驅動蛋白家族與癌癥的發生、進展、侵襲和轉移有著密切的關聯[17-21]。例如，膀胱癌機制研究發現，驅動蛋白家族成員KIF2A 的敲除作用可以有效抑制膀胱癌細胞的增殖和轉移，另外，進一步的臨床研究分析發現，高表達KIF2A的膀胱癌患者顯示癌組織低分化，且預后情況不良[18]。此外，有研究表明，驅動蛋白家族另一成員KIF4 可以通過調控微管結合蛋白（Mitotic Centromere-associated Kinesis，MCAK）促進癌細胞抗藥性的產生，而敲除KIF4 基因可以抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且進一步的動物模型研究證實了KIF4 基因敲除可以減慢腫瘤的發展速度[19]。作為KIF 家族成員之一，有研究表明，KIF2A 可以作為促癌基因，參與一些惡性癌癥的發生與進展過程[10-12]。而有關KIF2A與結直腸癌患者腫瘤特征、預后關聯，以及KIF2A 敲降對于結直腸癌細胞作用的相關研究尚少。

本研究通過IHC 檢測結直腸癌患者癌組織及癌旁組織中KIF2A的表達水平，發現KIF2A在癌組織中的表達水平較癌旁組織更高。猜測可能的原因是：①有研究表明，KIF2A 可以調控染色體的運動、雙極紡錘體、細胞有絲分裂等細胞核內活動[22]，因而KIF2A的高表達可能導致染色體的突變、阻止DNA 的修復，從而導致結腸癌的形成。因此結直腸癌患者癌組織切片顯示KIF2A 高表達。②KIF2A 基因可以通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路[23]，增強PI3K 內在激酶活性的突變，導致AKT 信號傳導失調，影響PI3K/AKT 信號通路中關鍵編碼基因如：AKT 的結構改變，導致細胞的癌變和腫瘤的發生，因此KIF2A在結直腸癌患者中顯示高表達。

有證據表明，在一些癌癥中，癌組織KIF2A 高表達與較差的腫瘤臨床特征相關[12-13,24]。例如，癌組織KIF2A 表達與肺腺癌患者的TNM 分期和淋巴結轉移征相關[13]。此外，在乳腺癌患者中，癌組織KIF2A 與淋巴結轉移、乳腺癌遠端轉移、HER2陽性呈正相關[14,24]。本研究發現，KIF2A 與較大的腫瘤直徑、淋巴結轉移、以及較高的TNM 分期正相關。可能的原因包括：①根據既往報道，KIF2A 在卵巢癌中可通過靶向抑制抑癌基因微小RNA（miRNA）-206，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而miR-206在結直腸癌細胞中低表達，可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。綜合以上證據，我們猜測KIF2A可能通過與miR-206 的相互作用，促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，進而與更差的腫瘤特征相關[12,24]。②此外，有研究表明，KIF2A可通過異常激活PI3K/AKT 通路，同時PI3K 表達量的升高可促使AKT 蛋白的磷酸化，導致AKT 的活化，進而啟動其下游靶蛋白以及通路下游的級聯反應，促進腫瘤細胞的異常增殖、存活、遷徙，造成患者較差的腫瘤特征[10,25]。除此之外，異常激活的PI3K/AKT 信號通路，可造成PIK3CA 蛋白表達量的異常升高，而PIK3CA 蛋白表達量的升高與結直腸腫瘤病人的不良臨床特征相關，因此KIF2A與結直腸癌患者更差的腫瘤特征相關。此外，我們進一步探究了KIF2A在結直腸癌患者中作為預后標記物的潛能并發現，KIF2A 高表達是結直腸癌患者較差生存的獨立預測因素?？赡艿脑虬ǎ孩貹IF2A 可能通過異常激活PI3K 通路，導致PIK3CA 的突變和抑癌基因PTEN 表達的丟失，引起患者對于抗腫瘤藥物的耐藥性，使患者治療應答變差，進而導致較差的預后[23,26]。②根據本研究結果，KIF2A 高表達與較差的腫瘤特征相關，因此KIF2A高表達的患者病情可能較為嚴重，導致預后情況較差。

進一步研究KIF2A 對于結直腸癌細胞影響的實驗結果表明，在結直腸癌細胞中，敲降KIF2A 可抑制細胞增殖、侵襲，并促進細胞凋亡，但對細胞的遷移的促進作用并不顯著?？赡艿脑虬ǎ孩偾媒礙IF2A 可能通過PI3K/AKT 信號通路，抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲，促進凋亡。隨后，本研究通過檢測敲降KIF2A 對PI3K/AKT 信號通路上的PI3K和p-AKT蛋白水平的影響，驗證了敲降KIF2A對于PI3K/AKT信號通路的抑制作用；②此外，敲降KIF2A 可能抑制上皮間質轉化，從而抑制結直腸癌細胞的干性以及相關的PI3K/AKT 信號通路，削弱腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲能力[25,27]。

本研究尚有一些局限性：①本研究是單中心、回顧性研究，結直腸癌患者來源較為單一，可能存在患者選擇性偏移和地區限制。②本研究已排除包括：復發或者繼發性結直腸癌、出現遠端轉移、有其他腫瘤史或有新輔助治療史的結直腸癌患者，因而KIF2A 在這些患者中的預后作用需要進一步的研究。③由于患者大多是從外地到本院就醫，因此他們的腫瘤復發時間很難準確計算，因此KIF2A與結直腸癌患者的無病發展期需要進一步的研究。④KIF2A 在結直腸癌中的作用需要選取更多的細胞株以及進一步動物模型進行驗證。

綜上所述，KIF2A 與結直腸癌的腫瘤特征以及不良預后相關，且敲降KIF2A 可抑制PI3K/AKT 信號通路的激活，從而抑制結直腸癌細胞惡性增殖、侵襲能力，表明其有成為結直腸癌標志物的潛能。