Fn 2118蛋白對結腸癌細胞胱氨酸代謝影響的研究

丁 楠，王婷婷，蘇 婷

結直腸癌（Colorectal Carcinoma，CRC）是全球致死率排名第三的惡性腫瘤。目前中國CRC 發(fā)病率成明顯上升趨勢,已被認為是對現(xiàn)代社會人類健康的長期威脅[1]。越來越多的證據(jù)表明，代謝改變與腫瘤的發(fā)生密切相關[2]。來自多細胞生物的微生物和細胞在相似的環(huán)境條件下具有相似的代謝表型。胱氨酸作為亞牛磺酸合成的原材料，已被證實在CRC和癌旁組織中的含量存在顯著性差異[3]。

大量文獻報道腸道微生物菌群與CRC 有關。有研究證實，具核梭桿菌僅在CRC 中刺激增殖，但在非腫瘤細胞中不刺激增殖[4-6]。本次研究對象Fn 2118 蛋白即是具核梭桿菌蛋白組中一段功能未知的蛋白片段，由245個氨基酸構成，以前并沒有針對此蛋白片段的任何研究。Yoshida等[7]證明具核梭桿菌的幾種蛋白片段，會與環(huán)境中的胱氨酸產(chǎn)生反應，生成相應產(chǎn)物,所以研究蛋白Fn 2118 對CRC細胞胱氨酸代謝影響，可以為更深入研究CRC發(fā)生發(fā)展機制及日后提高CRC預后做好理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 人CRC 細胞（ATCC）HCT-116 和LoVo 細胞，均購自上海子實生物科技有限公司。Fn 2118蛋白由大連民族大學許永斌課題組提取純化捐贈。

1.2 主要儀器及試劑 三氣二氧化碳培養(yǎng)箱、超純水儀、臺式冷凍大容量離心機、凝膠成像系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司），倒置顯微鏡（日本尼康株式會社）,超凈工作臺(青島海爾股份有限公司)，PCR擴增儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），蛋白電泳槽、半干轉印槽（美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司），酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司），微量蛋白核酸分析儀（澳大利亞生命動力亞洲有限公司），PH儀、電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多國際貿易有限公司）。DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA（美國Gibco 公司），PBS 緩沖液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗（美國HyClone 公司），Cell Proliferation Reagent WST-1（瑞士Roche 公司），RNAiso Plus、PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）（日本TaKaRa BIO株式會社），氯仿、甘氨酸（上海國藥試劑公司）、異丙醇、無水乙醇、甲醇（中國天津市科密歐化學試劑有限公司）Tris、SDS（中國北京索萊寶科技有限公司），SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（中國Biosharp 公司），BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白電泳Marker、CDOPolyclonal Antibody（美國賽默飛世爾科技公司），PVDF膜（0.22 μm）（美國默克密理博公司），脫脂奶粉（中國內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司），xCT(SLC7A11) Rabbit Polyclonal Antibody、Anti-ADORabbit Polyclonal Antibody（美國OriGene Technologies 公司），HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（中國武漢愛博泰克生物科技有限公司），Antibeta Actin antibody（美國艾博抗上海貿易有限公司），超敏ECL發(fā)光液（中國Tanon生物公司）。

1.3 引物 實驗所需要的引物，由日本Takara 公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.4 細胞培養(yǎng) 所有培養(yǎng)細胞相關過程全程要有無菌概念，避免細胞污染。25 cm2接種完細胞的培養(yǎng)瓶加入DMEM 細胞培養(yǎng)基，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細胞傳代 提前解凍胰酶，傳代前觀察待傳代細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)。吸去舊培養(yǎng)基，用5 mL無菌PBS 清洗3 次，加入1 mL 0.25% EDTA 胰酶消化至貼壁細胞變圓脫壁，加入5 mL 含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化。反復輕柔的吹打消化好的細胞至脫壁形成單細胞懸液打入15 mL 離心管中。3000 rpm 離心3 min，棄上清，用DMEM 細胞培養(yǎng)基重懸，根據(jù)需要將細胞打入新的培養(yǎng)容器中待用。

1.6 細胞增殖實驗（WST-1 法）于96 孔板種接種細胞（7000 個/孔），每種細胞每實驗組接種3 個平行孔，接種細胞后應于96 孔板外圍孔加蒸餾水，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。放置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中24 h細胞穩(wěn)定后，棄去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS 清洗3 次后，取其中一組，加入WST-1工作液（PBS和WST-1試劑按照100：10 配制）100 μL，37℃孵育1.5 h 后，放入酶標儀檢測吸光度，取平均值得到空白對照。其他實驗組按照實驗要求更換培養(yǎng)基，刺激48 h后進行WST-1 實驗。用DMEM 完全培養(yǎng)基將一定濃度的蛋白Fn 2118 稀釋成1000 μg/mL、200 μg/mL、40 μg/mL、8 μg/mL、1.6 μg/mL、0.32 μg/mL、0.064 μg/mL 組，加上無蛋白Fn 2118 的空白組，每孔加入100 μL，每組三個平行孔。為防止蛋白降解，含蛋白Fn 2118的培養(yǎng)基每24 h更換一次。

1.7 Rt-PCR 實驗 根據(jù)細胞增殖檢測結果（結果2.1），選取實驗組（1000 μg/mL）和對照組（0 μg/mL）。兩種細胞接種于六孔板中，每孔接種量為70000/孔，5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后用PBS 清洗3次，按上述實驗分組要求在培養(yǎng)基（1 mL/孔）中加入試劑，每組4 個平行對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 候進行提取。倒出培養(yǎng)液，用無菌PBS 清洗3 次。提取步驟按照日本寶生物公司RNAiso Plus 試劑說明書進行，得到實驗所需RNA產(chǎn)物。A260/A280可得到核酸的純度，查看mRNA 濃度及純度，符合要求方可進行后續(xù)實驗。cDNA 擴增體系及擴增條件，按照日本寶生物公司PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進行，引物用無菌超純水復溶即可。

1.8 Western Blot 實驗 根據(jù)細胞增殖檢測結果（結果2.1），選取實驗組（1000 μg/mL）和對照組（0 μg/mL）兩種細胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，每孔接種量為3×105/孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后用PBS 清洗3次，按上述實驗分組要求在培養(yǎng)基（4 mL/皿）中加入試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進行蛋白提取。每1mL RIPA 加入10 μL PMSF，，裂解液混勻備用，現(xiàn)用現(xiàn)加。用PBS 沖洗貼壁細胞3 次，加入1mL 裂解液，細胞用刮鏟，吸入EP 管，放置冰上裂解30 min。14000×g，4℃離心5 min，取上清。按照50 體積BCA 工作液+1 體積Cu2+配制工作液，在96 孔板中加入10 μL 按要求稀釋好梯度的標準品和提取的蛋白，加入200 μL 工作液，37℃放置30 min，酶標儀562 nm 測吸光度，繪制標準曲線，從而根據(jù)吸光度值得蛋白濃度。用4×SDS PAGE Loading Buffer加入提取好的蛋白樣本后，震蕩混勻，99℃，5min，煮沸變性后，放置到冰上冷卻，即可電泳。配置12% SDS-PAGE 膠。每孔上樣量為20 μg，Marker上樣量5 μL，濃縮膠電泳用恒定電壓80V，30 min，分離膠電泳用恒定電壓150 V。轉印采用恒定電流50 mA，50 min。用5%脫脂奶粉（脫脂奶粉+TBST）封閉，室溫震蕩1 h。用封閉液以相應濃度稀釋βactin（1:3000）、SLC7A11（1:500）、ADO（1:500）和CDO（1:250）抗體，4℃過夜孵育。隨后將膜5 min（震蕩）洗滌3 次。在封閉液稀釋好的羊抗兔二抗（1:5000）中，放入洗滌好的PVDF 膜室溫孵育1 h，隨后將膜5 min（震蕩）洗滌3 次。Working Solution(A 液B 液，等量混合），室溫靜置2 min，按照檢測儀器的使用方法操作，曝光條件根據(jù)每種條件每種抗體的曝光效果確定。

1.9 統(tǒng)計學處理 應用Minitab 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用（）表示。組間比較采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗，P<0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛋白Fn 2118 對結直腸癌細胞HCT-116、LoVo增殖的影響 為了研究Fn2118 蛋白對結直腸癌細胞HCT-116、LoVo 增殖產(chǎn)生的影響，用WST-1 法對不同濃度Fn 2118 蛋白刺激48 h 后的細胞進行檢測，結果如下圖（圖1A、1B）所示。用單因素方差分析（one-way ANOVA），蛋白X 濃度對細胞增殖的影響間都具有統(tǒng)計學意義。隨后我們對1000 μg/mL和0 μg/mL 的吸光度值進行獨立樣本t檢驗，說明Fn 2118 蛋白會促進三種細胞的增殖，繼而也確定了之后PCR 實驗和Western Blot 實驗的實驗組（1000 μg/mL）和對照組（0 μg/mL）濃度。

圖1 不同濃度蛋白Fn 2118對兩種細胞增殖的影響

2.2 蛋白Fn 2118 對結直腸癌細胞HCT-116 和LoVo 4 種胱氨酸代謝相關基因的影響因為蛋白Fn 2118 為功能未知的“hypothetical protein”，所以在前序實驗證實蛋白Fn 2118可以促進人結直腸癌細胞HCT-116、LoVo 增殖后，本研究選取了3 種與胱氨酸代謝通路相關基因，并對其表達情況進行了檢測，包括SLC7A11、ADO、CDO。內參基因選擇βactin（ACTB）。結果顯示，蛋白Fn 2118刺激后降低了HCT-116 細胞CDO 基因的表達和LoVo 細胞SLC7A11、ADO、CDO基因的表達。

2.3 蛋白Fn 2118 對CRC 細胞HCT-116、LoVo 相關蛋白表達的影響前序實驗證實蛋白Fn 2118 可以對人結直腸癌細胞HCT-116、LoVo 一些基因（如CDO）的表達產(chǎn)生影響，選取兩種細胞有共同差異的3 種基因（與胱氨酸代謝相關的SLC7A11、ADO、CDO）相對應的蛋白表達情況進行Western Blot 檢測。內參抗體選擇β-actin（ACTB）。結果如圖3 所示，與基因表達結果基本一致。降低了HCT-116細胞CDO蛋白的表達。降低了LoVo 細胞SLC7A11、ADO、CDO蛋白表達。

圖3 蛋白Fn 2118刺激兩種結直腸癌細胞后3種蛋白表達差異情況

3 討論

西方化的生活方式，特別是近幾十年來中國肥胖和缺乏運動人群的患病率增加，對大腸癌發(fā)病率的上升產(chǎn)生了影響[8-9]本研究中，選擇為ATCC 認證的人CRC細胞HCT-116和LoVo作為實驗對象。而Fn 2118 蛋白，作為具核梭桿菌中的一個含有245個氨基酸的蛋白片段，對其功能及相關機制的研究尚屬首次。

首先，本研究采用WST-1 法，對不同濃度具核梭桿菌功能未知蛋白片段Fn 2118 刺激下的細胞增殖情況進行檢測，結果表明，蛋白Fn 2118 會促進兩種CRC 細胞的增殖，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）,選出合適的實驗組（1000 μg/mL）和對照組（0 μg/mL）濃度，而Fn 2118 蛋白促進細胞增殖的機制，則有待繼續(xù)研究。

在選定濃度的蛋白Fn 2118和胱氨酸的分別刺激下，本研究檢測了3 種與胱氨酸代謝通路相關基因（SLC7A11、ADO和CDO）。并隨后根據(jù)PCR 實驗結果，確定了后續(xù)Western Blot檢測的目的蛋白。蛋白Fn 2118 刺激后降低了HCT-116 細胞CDO 基因和CDO 蛋白的表達，同時降低了LoVo 細胞SLC7A11、ADO、CDO基因和SLC7A11、ADO、CDO蛋白的表達。

圖2.1 蛋白Fn 2118刺激HCT116細胞24 h后3種基因表達差異情況

圖2.2 蛋白Fn 2118刺激LoVo細胞24 h后3種基因表達差異情況

胱氨酸生物學最近在腫瘤生物學方面?zhèn)涫荜P注，因為它涉及活性氧（ROS）的產(chǎn)生并通過CD44-2118c-（腫瘤干細胞-標記半胱氨酸轉運蛋白）軸影響癌細胞的化療敏感性[10-11]。SLC7A11（2118c-胱氨酸/谷氨酸轉運體）是細胞攝取胱氨酸以交換細胞內谷氨酸的主要胞膜轉運體。其主要功能之一，介導細胞攝取胱氨酸，特別是維持細胞內谷胱甘肽水平，以保護細胞免受氧化應激和外源性物質的保護[12-14]。體內現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩條亞牛磺酸合成途徑[15]:①胱氨酸分解成半胱氨酸后經(jīng)半胱氨酸加雙氧酶（CDO，EC1.13.11.20）轉化成半胱亞磺酸，再經(jīng)脫羧酶（CSAD）作用生成亞牛磺酸；②半胱氨酸與輔酶A 結合，產(chǎn)生半胱胺，后者經(jīng)半胱胺加雙氧酶（ADO,EC1.13.11.19）催化生成亞牛磺酸，亞牛磺酸最終可氧化成牛磺酸。

尤其半胱氨酸雙加氧酶（CDO）是半胱氨酸分解代謝過程中的關鍵步驟。半胱氨酸生物學最近在腫瘤生物學方面?zhèn)涫荜P注，因為它涉及活性氧（ROS）的產(chǎn)生并通過CD44-xc-（腫瘤干細胞-標記半胱氨酸轉運蛋白）軸影響癌細胞的化療敏感性[16-17]。CDO影響胞嘧啶代謝，導致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，降低細胞活力和生長[18-19]。因此，CDO被認為是一個重要的腫瘤抑制基因，可以作為腫瘤細胞化療耐藥的標志。實驗結果顯示，蛋白Fn 2118 蛋白在促進兩種腫瘤細胞增殖的同時，均下調了CDO基因和蛋白的表達，與前面報道的CDO的抑癌作用方向一致。

由于國內外還未有實驗室研究過具核梭桿菌功能未知蛋白片段Fn 2118 和胱氨酸濃度對CRC的影響，所以此次本研究也是一種篩選性實驗。蛋白Fn 2118 對SLC7A11、ADO、和CDO表達的影響使我們有充分的理由相信其在胱氨酸代謝中具有一定的調控作用，相關機制有待后續(xù)，日后將從分子水平進行對整個通路相關的信息進行更多實驗及更為深入的研究。