Rab10通過介導肝癌細胞上皮間質轉化促進肝癌轉移

高明萱，雍遇樂，劉澤昆，陸蒙

肝癌在全球惡性腫瘤中發病率排名第七，死亡率排名第四，從全球來看，我國肝癌的發病率和致死率都居于世界首列[1]，其中肝細胞癌（Hepatocel‐lular Carcinoma,HCC）是最主要的肝癌類型，由于其高復發、高轉移，患者接受治療的5 年生存率較低[2]，因此，研究肝癌轉移的潛在機制，對于預防HCC 患者轉移的發生、制定晚期HCC 患者的治療策略均具有重要意義。

Rab10 是小分子GTP 酶家族的成員，具有GDP和GTP 結合域，主要參與蛋白的囊泡運輸[3-4]。Rab10的表達和活化均會影響蛋白和脂質的合成與轉運。研究發現，活化的Rab10 破壞VSVG 到達細胞基底側膜的定位分選，使其部分位于頂端膜[5]。在上皮細胞早期極化過程中，Rab10 從高爾基體運輸開始發揮作用，并與Rab8 合作參與蛋白質向基底側膜的轉運[5]。此外，Rab10蛋白作為Ras家族成員，參與腫瘤發生和進展。例如，長鏈非編碼RNA LINC00152通過miR-107/Rab10調控食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。MiR-329 通過下調Rab10抑制骨肉瘤的發展[7]。在HCC 中，Rab10 過表達通過多種致癌、細胞應激和細胞凋亡途徑來調節細胞存活和增殖，最終促進腫瘤發生[8]。MicroRNA-519d/Rab10 可通過激活AMPK 通路誘導肝癌細胞自噬和凋亡[9]。盡管最近的研究表明Rab10 的表達與肝癌細胞的增殖和凋亡密切相關，然而，關于Rab10在肝癌轉移中的作用目前尚無報道。

本研究將探討Rab10 表達對肝癌遷移和侵襲的影響。首先，通過對美國癌癥基因組圖譜（Can‐cer Genome Atlas，TCGA）和基因表達匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）兩個腫瘤數據庫的分析發現Rab10 mRNA 在HCC 患者中高表達，并且Rab10 的表達與肝癌病人生存密切相關。然后，利用特異靶向Rab10 的小RNA 干涉片段，明確干涉Rab10 可通過調控上皮間質轉化（Epithelial-Mes‐enchymal Transition，EMT）來降低HCC 細胞的遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HCC-LM3細胞購于上中國科學院上海生科院細胞資源中心，E-cadherin、N-cadherin 和Snail 抗體購于武漢三鷹生物有限公司，Rab10 多克隆抗體購于Abcam 公司，α-tubulin單克隆抗體為空軍軍醫大學細胞生物學教研室制備，轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1）購于美國Peprotech 公司。DMEM 培養基、細胞消化液、谷氨酰胺、青鏈霉素均購于美國Invitrogen 公司，胎牛血清購自于杭州四季青公司，Rab10 干涉與對照片段購于上海吉瑪基因公司，LipofectamineTM 2000 轉染試劑購于美國Invitrogen公司，細胞裂解液RIPA 與PMSF 購于上海碧云天生物技術公司，二辛可寧酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于英國Pierce 公司，發光液EnlightTM 購于北京英格恩生物科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-Time fluores‐cence Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）所用試劑盒為反轉錄試劑盒和SYBR Pre‐mix Ex TaqTM 購于大連寶生物工程公司，主要儀器Real-time PCR 儀購自美國Agilent 公司，電泳儀與電泳槽、發光儀、流式細胞儀均購自美國BD 公司，酶聯免疫檢測儀購自美國BioTek 公司、倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司，Image Station 4000 MM Pro和XLS180 光信號采集系統為美國Kodak公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 人肝癌細胞系HCC-LM3用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，培養于溫度37 ℃，5% C02濃度，飽和濕度的培養箱中，隔天換液。細胞轉染時取對數生長期的HCC-LM3細胞懸液接種于6 孔板中，培養至細胞密度70%后進行轉染，轉染步驟及劑量嚴格按照LipofectamineTM 2000轉染說明書步驟，分別用設計的Rab10特異性小干擾RNA（Small Interfering RNA，SiRNA）片段和陰性對照片段（表1）來實現Rab10的下調表達。

1.2.2 分組 按照Rab10 干涉情況可分為Si-Rab-1,Si-Rab-2,Si-Rab-3 組和陰性對照組（Negative Control,NC）。按照處理因素可分為4 組，空白對照組（不加TGF-β1），TGF-β1 刺激組（加入5 ng/ml TGF-β1 刺激24h），TGFβ1+NC組（在陽性對照組加入5 ng/ml TGF-β1）和TGF-β1+Si-Rab10-3 組（在干涉Rab10組加入5 ng/ml TGF-β1）。

1.2.3 蛋白提取與Western Blot HCC-LM3細胞于轉染48 h 后，加入TGF-β1（5 ng/mL），24 h 收集細胞，用RIPA 裂解緩沖液裂解細胞，4 ℃裂解30 min,13000 rcf 離心30 min,提取細胞總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，用10%SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，轉膜，孵育一抗Rab10（1：300）、E-cadherin（1：1500）、N-cadherin（1：1500）、Snail（1：500）和αtubulin（1：50）,4 ℃過夜孵育，用TBST 緩沖液洗去一抗，滴加同種屬二抗室溫孵育1 h，再用TBST 緩沖液洗去二抗，用化學發光液進行發光。

1.2.4 RNA 提取和RT-qPCR 依照RNA 提取試劑盒說明書提取HCC-LM3 的RNA，并將其反轉合成為cDNA。使用Primer Blast 進行引物設計，序列如下，Rab10：上游引物5’-CTGCTCCTGATC‐GGGGATTC-3’，下游引物5’-TGATGGTGT‐GAAATCGCTCCT -3’;GAPDH:上游引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’。使用SYBR Premix Ex TaqTM，配制20 μL反應體系：SYBR 10 μL；Primer Forward 0.8 μL；Primer Reverse 0.8 μL；cDNA 2 μL；DEPC H2O 6.4 μL，將反應體系加入八連管中，混勻后離心，放入實時定量PCR儀中。

1.2.5 基質膠侵襲實驗與遷移實驗 在24 孔板中預先鋪設Transwell 小室，對于侵襲實驗，提前加入用培養基稀釋好的Matrigel稀釋液（1:5）100 μL，置于37 ℃培養箱3 h,使Matrigel 膠凝固，遷移實驗直接鋪設Transwell小室。準備轉染48 h的HCC-LM3細胞，TGF-β1（5 ng/mL）刺激24 h 后，消化、離心用無血清培養基重懸，細胞計數約1×105個/mL。取細胞懸液加入小室，上室每孔加200 μL 的細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基500 μL，繼續培養。再培養18 h 后，取出Transwell 小室，用0.2%結晶紫/95%乙醇固定染色，清水中涮洗，再用干凈的棉簽去除上層的細胞，風干過夜后進行拍照計數。每組實驗重復3次，取均值。

1.3 統計學處理 通過SPSS16.0 分析軟件，采用Kaplan-meier 法進行總生存時間分析。計量資料采用“均數±標準差（）”表示，統計分析用Graphpad prism 軟件，組間比較采取t檢驗，P<0.05為存在顯著差異。

2 結果

2.1 臨床HCC組織中，Rab10表達與預后的相關性分析 為了明確Rab10 在HCC 患者組織中的表達，我們通過TCGA-LIHC 數據庫和GEO 數據庫（GSE22058），首先分析了Rab10 的mRNA 表達，其中，TCGA-LIHC 數據庫包括371 例原發性肝癌腫瘤和50 例非腫瘤癌旁組織，GEO 數據庫包括96 例原發性肝癌腫瘤和相對應的癌旁組織。TCGALIHC 和GEO 數據分析顯示，癌旁組織中Rab10 的mRNA水平顯著低于HCC組織，差異具有統計學意義（圖1A）。接著，對TCGA-LIHC 的肝癌病人進行總體生存分析，結果表明Rab10高表達的HCC患者生存率低（P<0.0001，圖1B）。

圖1 Rab10對臨床預后的影響

2.2 Rab10 對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響Western Blot 和RT-qPCR 結果顯示，與陰性對照組（Negative Control，NC）比較，siRab10-3 組中Rab10蛋白和mRNA 水平顯著降低（圖2A，圖2B）。接下來，利用此干涉片段和NC組進行細胞功能實驗，遷移實驗顯示，穿過小室的NC 組細胞數為194.30±5.78，與對照組比較，干涉Rab10 組細胞穿過數目為68.67±12.81，干涉Rab10降低了HCC-LM3細胞的遷移能力（P=0.0009，圖2C）。同時，細胞侵襲實驗顯示，干涉Rab10 降低了HCC-LM3 細胞的侵襲能力（P=0.0139），其中NC 組和Si-Rab10-3 組穿過小室的細胞數分別為139.3±16.59 和64.00±7.02（圖2D）。

圖2 兩組細胞遷移和侵襲能力的比較

2.3 Rab10 對TGF-β1 誘導的肝癌細胞EMT 的影響 Western Blot結果顯示，在HCC-LM3細胞中，與對照組比較，干涉Rab10 后E-cadherin 表達上調，同時N-cadherin 和Snail 表達下調(圖3A)。TGF-β 1 刺激后，E-cadherin 表達下調，N-cadherin 和Snail表達上調，而相比于NC 組，干涉Rab10 則升高Ecadherin 的表達，降低N-cadherin 和Snail 的表達，即干涉Rab10 抑制了由TGF-β1 引起的E-cadherin下降和N-cadherin、Snail 表達的升高（圖3B）。TGF-β1 誘導肝癌細胞EMT 的過程中，肝癌細胞的遷移和侵襲能力增強，Transwell遷移和侵襲實驗也證實此結論，與空白對照組（細胞遷移數為216.30±5.55；細胞侵襲數為211.00±17.78）比較，TGF-β1 組可明顯增強HCC-LM3 細胞的遷移（細胞遷移數為531.00±3.79，P<0.0001）和侵襲能力（細胞侵襲數為448.70±24.22，P=0.0014）。然而，TGF-β1 刺激下，與NC 組相比（細胞遷移數為533.30±4.37；細胞侵襲數為480.70±4.06），干涉Rab10 后肝癌細胞的遷移（細胞遷移數為166.30±8.01，P<0.0001）和侵襲能力降低（細胞侵襲數為125.70±12.13，P<0.0001，圖3C）。

圖3 Rab10對肝癌細胞EMT的作用

3 討論

Rab GTP 酶可作為細胞膜系統的核心調控因子，在生理狀態下，維持胞內蛋白的轉運，膜性結構的轉運和細胞骨架的穩定。當轉運功能障礙時，可導致機體出現從感染性疾病到癌癥不等的多種疾病狀態[10]。尤其值得注意的是，作為一個轉運相關分子，近些年越來越多的報道指出Rab10在多種惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[11-12]。目前，Rab10在HCC 中研究仍處于初級階段，在肝癌發生階段的增殖和凋亡方面少有報道，而對于該蛋白在肝癌進展中的作用未有研究。因此，我們將關注點放在了Rab10 在HCC 轉移中的作用。首先，通過TCGA-LIHC 和GEO 兩個癌癥相關數據庫的分析發現與癌旁組織相比，Rab10 在HCC 組織中mRNA顯著高表達。然后，通過與肝癌轉移相關的細胞功能實驗證實，干涉Rab10顯著降低HCC細胞的侵襲和遷移能力。綜上，Rab10 不僅在肝癌的形成和增殖方面發揮了重要作用，該蛋白在肝癌轉移方面的作用也不可忽視。

通常EMT 的發生被認為是轉移的啟動子，是腫瘤細胞遷移和侵襲的重要步驟[13]，具有極性的上皮細胞轉化為間質細胞，并獲得侵襲和轉移能力。經歷EMT 的細胞，其形態和功能都會發生改變，喪失頂端-基底極性和細胞-細胞間的連接，既可以穿透基底膜和間質組織，還可以穿過循環系統至遠處組織[14-15]。那么，Rab10 對肝癌細胞的遷移和侵襲是否是通過EMT 呢？于是，我們檢測了干涉Rab10后對上皮細胞標志物E-cadherin和間質細胞標志物N-cadhein、Snail 表達的影響，結果顯示，HCC-LM3 細胞中，下調Rab10 后，E-cadherin 表達上調，N-cadherin和Snail表達下調。

TGF-β1是公認的EMT誘導因子，在HCC發生和發展中發揮著重要的作用，其可以通過與細胞膜上的受體結合，激活Smad 通路（Smad2、Smad3 和Smad4），最終促進EMT 的形成[16-18]。另外，TGF-β1可以破壞上皮細胞極性和細胞連接，誘導癌細胞發生EMT，促進腫瘤的轉移，其中包括E-cadherin、Ncadherin、Snail、Twist 等分子表達的改變[19-21]。為了更加明確Rab10表達與EMT的相關性，我們建立了TGF-β1 誘導的肝癌細胞EMT 模型，本研究通過Western Blot 發現，降低Rab10 的表達可以增加TGF-β1 下調的上皮標志物E-cadherin 蛋白表達，降低TGF-β1上調的間質標志物N-cadherin和Snail蛋白表達。進一步功能實驗證實，干涉Rab10抑制了TGF-β1 引起的肝癌細胞的遷移和侵襲，總之，Rab10 的表達會影響肝癌細胞發生EMT 進而調控肝癌進展。這些結果表明：干涉Rab10 可抑制由TGF-β1增強的HCC-LM3細胞的遷移和侵襲能力，即Rab10可通過EMT調控肝癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，我們的研究發現癌基因Rab10 可通過介導EMT 影響HCC 的惡性進展。這樣，Rab10可作為一個潛在的肝癌晚期標志物，靶向Rab10可能成為一種新的針對晚期HCC 的治療策略，對今后肝癌的研究提供新理論和新思路。然而，我們只揭示了Rab10 在HCC 轉移中作用，我們認為，在這一進程中，一定有許多有趣的機制深埋在地下，值得我們進一步探索。