不同單一酸化劑及復合酸化劑體外抑菌能力比較研究

雷 燕，李瀚林，曾凡坤，孔 凌

（1.宜賓學院質量管理與檢驗檢測學部，四川宜賓644000；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都611130；3.英國百沃英生物科技有限公司上海代表處，上海201600；4.西南科技大學，四川綿陽621010）

酸化劑替代抗生素的效果較為穩定，在動物腸道健康中扮演著重要角色[1]。酸化劑在飼料中可以酸化飼料，降低飼料系酸力，改善飼料的適口性，從而提高動物采食量。酸化劑在幼齡動物機體中，可以起到補充胃酸不足，提高飼料的消化利用率，調節腸道微生態平衡等作用[2-4]。目前，市場上主流產品分為以補充胃酸不足的消化酸和以調節腸道微生態平衡的殺菌酸，形式以單一酸和復合酸為主。禁抗背景下，對于酸化劑的評估主要考慮提供氫離子的能力、殺菌能力、適口性等特點。

大腸桿菌（G-）、金色葡萄球菌（G+）是引起畜禽疾病的主要細菌，其流行范圍廣、發病率高，給畜禽養殖造成巨大的經濟損失[5-7]。研究表明，不同的酸化劑可抑制大腸桿菌和金色葡萄球菌的生長[8-10]。酸化劑抑菌作用主要通過2個路徑實現：一是在水溶液中通過解離出的H+，降低有害微生物生存環境的pH值，從而抑制有害微生物的生長；另一路徑是小分子的有機酸可以透過病原菌細胞壁，進入其細胞內解離出H+，病原菌因極力排除H+消耗ATP耗能而死，同時酸根離子還能干擾細菌DNA和RNA的合成，破壞病原菌細胞膜的完整性，達到抑菌殺菌的作用[1,11-13]。本試驗通過菌落法考察不同單一酸化劑以及復合酸在同等酸度的條件下抑菌能力的大小，為酸化劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同的單一酸化劑及復合酸化劑均由成都大帝生物科技有限公司提供。

無水乙醇（99.8%，分析純）；0.9%生理鹽水；LB肉湯培養基（杭州百思生物科技有限公司；活化菌種）；大腸桿菌、金色葡萄球菌抑菌圈培養基為營養瓊脂（杭州百思生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液配置

配置LB肉湯，經滅菌后分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，放至好氧培養箱培養18～24 h，用滅菌生理鹽水稀釋原菌液至10-3，作為試驗用菌懸液。對照選用無菌蒸餾水。

1.2.2 樣品前處理

酸化劑及復合酸酸度均以5 kg/t乳酸計。樣品前處理見表1。

表1 樣品前處理Tab.1 Samplepretreatment

1.2.3 涂布菌懸液

按照說明書要求配制選擇培養基，稀釋原菌液至10-3，用移液槍準確吸取150μL制備好的菌懸液，分別均勻涂布到營養瓊脂培養基上。

1.2.4 抑菌試驗

分別將不同酸化劑，按照表1設計添加量，準確稱取（感量0.001 g）至100 mL無菌容量瓶中，用無菌LB肉湯培養基（熱）溶解，待冷卻后再用LB肉湯稀釋至刻度，然后采用超聲50°C助溶30 min，制備成酸化劑溶解液。在無菌條件下，準確移取酸化劑制備溶解液9 mL于滅菌試管中，再用移液槍準確移取1 mL制備好的大腸桿菌、金色葡萄球菌10-3菌懸液接種于盛有9 mL酸化劑溶解液的試管中，混勻蓋塞，置于37°C培養箱中培養20～24 h，進行抑菌試驗；取出培養好的LB抑菌培養菌懸液，在無菌條件下，用移液管分別準確移取經培養后LB抑菌培養菌懸液1 mL接種于盛有9 mL生理鹽水中做10-1稀釋，選擇10-3稀釋倍數菌懸液作為涂布用菌懸液，用移液槍準確吸取150μL制備好的菌懸液于營養瓊脂培養基中涂布均勻，置于37°C培養箱中培養20～24 h，取出，觀察菌落數。

2 結果與分析

不同酸化劑對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果（見表2、表3）

金色葡萄球菌和大腸桿菌平板37℃培養20～24 h后，計數平板菌落數（CFU）。

由表2可知，在同等酸度（以乳酸計）條件下，不同酸化劑對金色葡萄球菌的抑菌強弱順序為：復合酸化劑＞甲酸＞苯甲酸＞富馬酸＞磷酸、乳酸、檸檬酸＞空白。

表2 不同酸化劑對金色葡萄球菌抑菌效果Tab.2 Antibacterial effects of different acidifierson Staphylococcusaureus

由表3可知，在同等酸度（以乳酸計）條件下，不同酸化劑對大腸桿菌的抑菌效果由強到弱的排列順序為：復合酸化劑＞富馬酸＞檸檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸＞空白。

表3 不同酸化劑對大腸桿菌平板菌落數計數Tab.3 Antibacterial effects of different acidifierson E.coli

3 討論

研究表明，單一酸化劑對于動物的生長性能可以起到促進效果，比如甲酸、檸檬酸以及苯甲酸在斷奶仔豬日糧以及育成豬日糧中添加，可以促進生長，提高飼料轉化率[14-16]。富馬酸可以提高仔豬的回腸消化率，有效促進仔豬平均日增重以及飼料轉化率[17-19]。酸化劑促進動物的生長性能與其抑菌殺菌作用密切相關[1,11-13]。本試驗中，單一酸化劑對革蘭氏陽性菌金色葡萄球菌抑菌能力依次為：甲酸＞苯甲酸＞富馬酸＞磷酸、乳酸、檸檬酸；對革蘭氏陰性菌大腸桿菌抑菌能力依次為：富馬酸＞檸檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸。有研究報道，甲酸、乙酸和丙酸的復合使用可以顯著降低家禽腸道內的彎曲桿菌數量[20]，并且復合酸化劑可以有效降低肉雞腸道中的大腸桿菌數量[21]。本試驗研究表明，在同等酸度條件下，復合酸化劑的抑菌能力優于單一酸化劑。在動物體內試驗也得到類似結果，在早期斷奶仔豬日糧中，添加復合酸化劑的效果優于單一酸化劑[22]。

不同的單一酸化劑，其溶解性及理化性質不同。因此，對不同的病原菌表現出不同的抑菌性能[23]，幾種單一酸化劑復配在一起，起到一定的協同作用，可起到協同增效的效果。使用檸檬酸以及山梨酸可以提高斷奶仔豬的生長性能，調節腸道代謝[24]；有機酸以及無機酸的混合可以減低大腸桿菌數量，同時提高乳酸菌數量[25]。因此，很多的商業產品使用酸化劑或其鹽的組合來實現協同效應。然而，在使用每種酸化劑之前，需要具體考慮其抑制作用及效果[26]，更需要進一步的試驗驗證。

4 結論

本試驗結果表明，復合酸以及單一酸化劑在體外抑菌試驗中，對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，復合酸的效果優于單一酸化劑。在實際生產應用中，需要對單一酸化劑以及復合酸化劑進行綜合評估，選擇最佳的酸化劑品種及劑量。