天冬糖苷散對南美白對蝦的安全性研究

謝小東，孫鈺博，季 露，謝映紅，肖 琦，韋英益，覃志彪，胡庭俊

（廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005）

中藥制劑具有天然、安全、藥效溫和等優點[1]，且能夠有效提高機體免疫力[2]、抑制病原微生物活性[3]。因為中草藥的低毒性、低耐藥性[4]、低刺激性等特性，近年來中草藥制劑的應用一直是養殖業關注的熱點。天冬糖苷散是通過中獸醫辯證論治，并結合現代藥理學研究而配伍成的組方，研制出的中獸藥復方制劑。方中天冬有養陰潤燥、清肺生津之功效，常用于肺燥干咳、內熱消渴[5]；三七有止血化瘀、活血定痛之功效[6]。從天冬和三七中提取的有效成分對試驗動物均有良好的免疫增強功效[7]。前期研究結果表明，天冬糖苷散具有提高動物免疫功能的作用，可用于因環境應激導致的免疫力低下的南美白對蝦養殖中。文章旨在觀察飼喂不同劑量天冬糖苷散對南美白對蝦的安全性，從而提出受試藥物的不良反應及臨床應用時的注意事項，為天冬糖苷散臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天冬糖苷散由廣西大學基礎藥理學實驗室研發，廣西普大動物保健品有限公司中試生產，產品批號20190724，100 g/包。

1.2 試驗動物

南美白對蝦450尾，體重（1.69±0.17）g，體長（4.84±0.22）cm，來自廣西南美白對蝦良種基地。南美白對蝦臨床表現健康、采食正常、蝦線正常，暫養于室內直徑300 L透明收納箱內。水溫（28±1）℃、pH值8、24 h充氧，養殖用水為海水配制，鹽度為25.0‰，每天換水1次，換水量1/4。試驗開始時放于300 L塑料箱中進行分組飼養；每天投喂4次（7：30、12：00、17：00、21：30)，每天投喂量為蝦體重的3%～5%，投喂1 h時后，清除剩余餌料。

1.3 給藥方式

采用與臨床應用相同的給藥途徑，拌餌投喂：將餌料粉碎，加入一定劑量的藥物，混勻，再重新制粒，烘干（或者將藥物和拌藥劑一起溶解以后和餌料拌勻，烘干）。按照要求拌餌料，連用35 d，從喂藥開始連續觀察35 d。

1.4 試驗設計

450尾試驗蝦隨機分為5組。設置1個空白對照組和4個試驗劑量組，用藥劑量分別為臨床推薦劑量的1、3、5、10倍量。試驗設計見表1.

表1 試驗設計Tab.1 Test design

1.5 臨床體征

試驗期間觀察南美白對蝦是否出現與藥物相關的不良反應，如體色、游動狀態等情況變化。從給藥開始連續觀察35 d，記錄南美白對蝦是否出現死亡。若出現死亡，將死亡蝦肝胰腺使用4%甲醛固定，用于石蠟固定，HE染色切片觀察。

1.6 樣品采集及前處理

分別在給藥第17 d、第35 d，每組取40尾蝦，5%檸檬酸三鈉無菌抗凝采集血淋巴，每2尾蝦合成一個血液樣品，2 000 r/min離心5 min，取上層血清，-20℃保存，用于血液生化指標分析；同時，采集肝胰腺，置于4%福爾馬林固定，用于組織學觀察。

1.7 測定指標及方法

1.7.1 生長性能

分別于試驗前、試驗第17 d、第35 d對受試蝦稱體重、肝胰腺重量，量體長，計算其肝體比、體長增長率、體重增長率。

1.7.2 血液生化指標

取抗凝血用于檢測肌酐（CRE）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）等指標，具體方法參考南京建成生物工程研究所相關試劑盒說明書。

1.7.3 病理組織學檢查

取4%甲醛固定后的肝胰腺，石蠟包埋切片、HE染色，鏡檢，拍照，觀察肝胰腺中各細胞形態的變化。

1.8 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 天冬糖苷散靶對南美白對蝦體指數的影響（見表2）

表2 天冬糖苷散對南美白對蝦體指數的影響Tab.2 Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeusvannamei body index(n=40)

由表2可知，連續飼喂不同劑量天冬糖苷散17 d時，1倍劑量組南美白對蝦體重、增重率、肝胰腺重量均顯著高于對照組（P＜0.05）；3倍劑量組南美白對蝦體長、增長率、肝胰腺重量均顯著低于對照組（P＜0.05），10倍劑量組體長、增長率、體重、增重率均顯著低于對照組（P＜0.05），但是其肝體比顯著高于對照組（P＜0.05），體重顯著低于其余各組（P＜0.05），但是肝體比顯著高于其余各組（P＜0.05）。

連續飼喂不同劑量天冬糖苷散35 d時，1倍劑量組南美白對蝦體長、增長率、體重、增重率顯著高于對照組（P＜0.05）；各給藥組肝胰腺重量、肝體比均顯著高于對照組（P＜0.05）；10倍劑量組體長、增長率、體重、增重率均顯著低于對照組（P＜0.05）。結果表明，連續飼喂35 d推薦劑量1、3、5倍的天冬糖苷散，可以不同程度地提高南美白對蝦的體重、肝胰腺重量以及肝體比，促進其生長，1倍劑量效果最好，但10倍天冬糖苷散推薦劑量對南美白對蝦生長有一定的影響。

2.2 天冬糖苷散靶對南美白對蝦血液生化指標的影響（見表3）

表3 天冬糖苷散靶對蝦血液生化指標的影響Tab.3 Effect of TianDongTangGan powder on Litopenaeus vannamei blood biochemical indexes（n=20）

由表3可知，連續飼喂不同劑量天冬糖苷散17 d時，與空白對照相比，各給藥組南美白對蝦的血淋巴中肌酐、甘油三酯、總蛋白含量及谷丙轉氨酶活性差異不顯著（P＞0.05），5倍、10倍劑量組南美白對蝦的血液中谷草轉氨酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），1倍劑量組谷草轉氨酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；1倍、3倍、5倍、10倍劑量組尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

連續飼喂不同劑量天冬糖苷散35 d時，只有5倍、10倍劑量組南美白對蝦血液中的尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.05）；在連續給藥35 d時，3倍、10倍劑量組肌酐含量顯著低于對照組（P＜0.05）。結果表明，在連續飼喂正常劑量不同倍數的天冬糖苷散35 d，5倍、10倍劑量對南美白對蝦有一定的影響。

2.3 肝胰腺組織病理切片結果（見圖1）

由圖1可知，在連續飼喂正常劑量不同倍數的天冬糖苷散后，各組肝胰腺形態于空白對照組相比，形態正常，僅10倍劑量組肝胰腺細胞與底膜分離間距增大，但其形態完整。

圖1 第35 d肝胰腺病理切片圖（HE，400 x）Fig.35 d hepatopancreas pathological section(HE,400 x)

3 討論

天冬糖苷散是由天門冬多糖和三七總皂苷按照一定比例混合而成。方中天冬是一味具有治療肺部疾病的常用中藥，味苦、平，入肺腎經，主治陰虛發熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、便秘、小便不利等。現代藥理學研究發現，天冬中含有甾體皂苷、多糖、氨基酸等有效成分，天門冬多糖是主要有效活性成分之一。

李夢鈺等[8]通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察，發現天門冬多糖構象為球形聚集狀、結構緊實；熱學特性結果顯示，天門冬多糖具有較高的熱穩定性，為其多領域的開發提供參考依據。藥效學研究表明，天門冬多糖可以活化巨噬細胞、顯著增加單核-巨噬細胞的百分數、增強單核-巨噬細胞的吞噬能力、誘導分泌多種細胞因子促進炎癥反應、增強機體的免疫應答[9]。趙怡等[10]研究發現，天門冬多糖能顯著提高環磷酰胺免疫抑制小鼠血液中細胞因子IFN-γ的水平和脾臟指數，表明天門冬多糖具有增強小鼠免疫功能的作用。張文勝[11]研究表明，天門冬多糖對骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs）和細胞系（MSC-2）均有明顯的抑制作用；而對原代淋巴細胞卻有促進作用。胡國明等[12]研究發現，天門冬多糖注射液能夠明顯增加試驗雞的平均日增重，促進雞的生長發育，是一種有效、安全的免疫增強劑。

三七總皂苷也是三七中發揮主要藥效作用的活性物質，具有清除自由基、抗炎、免疫調節等作用。研究表明，三七總皂苷可以直接抑制線粒體中活性氧的生成與累積，從而提高抗氧化應激能力[13]。姜輝等[14]研究發現，三七總皂苷能顯著抑制促炎因子的分泌，減輕大鼠肝纖維化程度，保護大鼠的免疫器官。馮曉異等[15]也發現，三七總皂苷可有效降低非酒精性脂肪肝大鼠轉氨酶活性及血脂指標，同時可以抑制NO/iNOS/NF-κB信號通路，減少肝損傷。陳毓等[16]研究表明，三七總皂苷具有較好的安全性，且在體外具有一定的細胞免疫活性和誘生細胞因子的能力，為三七作為免疫調節劑的開發提供新的參考依據。

以上研究均表明，天冬和三七總皂苷具有一定的抗炎和調節免疫能力的作用。實驗室前期研究發現，天冬糖苷散具有提高南美白對蝦免疫能力，并具有提高其抗急性氨氮應激的作用。

靶動物安全性試驗是新獸藥臨床試驗研究的重要部分。采用不同劑量的天冬糖苷散飼喂南美白對蝦，觀察其精神狀態等，檢測生理、生化及體重等相關指標的變化，如肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶等指標數值的變化，評價天冬糖苷散對南美白對蝦的生理、生化系統的影響，研究不同劑量天冬糖苷散對南美白對蝦的不良反應，為提供天冬糖苷散的臨床應用提供參考依據。在本試驗中，將不同劑量的天冬糖苷散連續飼喂南美白對蝦35 d后，1、3、5倍劑量組在一定程度上能促進南美白對蝦的生長和肝胰腺發育水平；血液生化指標結果顯示，1、3倍劑量組對南美白對蝦血液生化指標及肝胰腺無顯著影響。3、5倍劑量組尿素氮、肌酐數值偏高，而總蛋白數值平穩，說明天冬糖苷散對肝胰腺有一定的影響。此外，病理組織學切片結果顯示，除10倍劑量組，各給藥組與空白對照組無明顯差別，肝胰腺細胞結構完整，無明顯損傷；10倍劑量組蝦肝胰腺細胞與底膜有明顯分離，但仍結構完整、無破裂、壞死等現象。表明1～5倍劑量天冬糖苷散連續飼喂南美白對蝦35 d，對肝胰腺無不良影響，安全性較好。

4 結論

南美白對蝦連續飼喂1、3、5倍臨床推薦劑量的天冬糖苷散35 d后，可以提高南美白對蝦的體長、增長率、體重、增重率和肝胰腺重量以及肝體比；10倍推薦劑量對南美白對蝦生化及肝胰腺有一定的影響；但病理組織學切片結果顯示，10倍劑量組肝胰腺無實質性的損傷。研究表明，天冬糖苷散在1～5倍臨床推薦劑量下使用安全可靠。