材料介導(dǎo)細(xì)胞固定化技術(shù)在生物發(fā)酵中的應(yīng)用

高豪，陸家聲，章文明，2，董維亮，2，方艷，2，余子夷，信豐學(xué)，2，姜岷，2

（1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 211816；2 南京工業(yè)大學(xué)，江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇南京 211816；3 南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 211816）

固定化細(xì)胞是指固定在水不溶性載體上且能在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。現(xiàn)代固定化細(xì)胞技術(shù)是在固定化酶技術(shù)的推動(dòng)下發(fā)展起來(lái)的[1]。該技術(shù)被定義為把游離細(xì)胞通過(guò)化學(xué)或物理手段固定在限域空間內(nèi)，以減少外界不良環(huán)境對(duì)生物體的影響[2]，使其盡可能保持旺盛的代謝活性，且能被重復(fù)和連續(xù)使用的一種新興生物技術(shù)。細(xì)胞固定化技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)顯示出巨大的應(yīng)用潛力。比如，固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器因可以緩解高濃度底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用，已經(jīng)在生物發(fā)酵領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用[3-4]。

為了提高固定化細(xì)胞在生物發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用，本文分析了生物發(fā)酵中應(yīng)用的各種固定化材料，特別是膜材料（中空纖維膜和微米/納米纖維膜）的最新進(jìn)展，并對(duì)材料介導(dǎo)細(xì)胞固定化技術(shù)在微生物多細(xì)胞培養(yǎng)體系中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 固定化材料

根據(jù)其化學(xué)組成不同，固定化材料可分為高分子載體材料、無(wú)機(jī)載體材料和復(fù)合載體材料3類(lèi)。其中，高分子材料中的膜材料有良好的力學(xué)性能和易于調(diào)節(jié)的特性，在細(xì)胞固定方面已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[5]。在利用膜材料作為固定化材料時(shí)不僅需要考慮到其力學(xué)性能和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，也要考慮到材料表面粗糙度、親水性以及是否具有良好的生物相容性等。通過(guò)調(diào)節(jié)固定化載體材料的表面化學(xué)性質(zhì)已被證明可以提高固定化細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性。比如，多糖物質(zhì)是一種具有特異生物學(xué)功能的多羥基碳水化合物，將糖基固定于高分子聚合物膜表面，不僅可提高膜表面的生物相容性，而且能賦予其更多特殊的生物學(xué)功能（見(jiàn)圖1）。

1.1 高分子載體材料在生物發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1.1 天然有機(jī)高分子載體材料

圖1 膜表面糖基化處理用于浸入式固定化發(fā)酵

表1 利用天然高分子材料固定細(xì)胞進(jìn)行生物發(fā)酵

天然有機(jī)高分子材料主要包括來(lái)源于生物體內(nèi)（膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸）或生物體外的物質(zhì)（殼聚糖、海藻酸鹽）（見(jiàn)表1）。它們具有一般對(duì)生物無(wú)毒、傳質(zhì)性能較好和具有良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)的天然有機(jī)高分子載體材料有海藻酸鈉、果膠和殼聚糖等，已被廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵系統(tǒng)中。例如，海藻酸鈉可應(yīng)用于固定由熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum） 和熱解糖梭菌（C.thermolacticum）組成的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，提高了以木質(zhì)纖維素為底物生物乙醇的發(fā)酵性能[6]。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量提高了60%以上[6]。當(dāng)以木質(zhì)纖維素水解液為底物時(shí)，堿預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)和高pH會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量和收率降低[6]。海藻酸鈉固定化可通過(guò)物理包埋細(xì)胞形成微球，微球核心中可包埋C. thermocellum和C.thermolacticum。這種通過(guò)空間隔離的方式可使細(xì)胞免受發(fā)酵體系中有毒物質(zhì)的毒害，同時(shí)可提高細(xì)胞對(duì)pH 變化的適應(yīng)能力[6]。 干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可利用果膠酸鈣為固定化載體生產(chǎn)乳酸，實(shí)現(xiàn)了乳糖的高轉(zhuǎn)化率（94.37%），且在16 批乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸的發(fā)酵過(guò)程中保持穩(wěn)定[7]。當(dāng)糞腸球菌（Enterococcus faecalis）以殼聚糖為固定化載體時(shí)，實(shí)現(xiàn)了以L-精氨酸為底物大規(guī)模生產(chǎn)L-瓜氨酸。其中，在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上，1000kg的L-精氨酸可轉(zhuǎn)化為974.6kg的L-瓜氨酸[8]。同時(shí)，固定化細(xì)胞也可有效緩解攪拌器對(duì)細(xì)胞膜的損傷，細(xì)胞的力學(xué)性能可得到顯著改善。如在利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-精氨酸合成L-瓜氨酸過(guò)程中，經(jīng)過(guò)5 批發(fā)酵后產(chǎn)物收率仍高達(dá)98.9%，而游離細(xì)胞在第二批的收率僅有68.2%[8]。

天然有機(jī)高分子載體材料在固定細(xì)胞過(guò)程中也存在一些缺點(diǎn)，如機(jī)械強(qiáng)度較低、彈性差、在厭氧條件下易被微生物分解等。海藻酸鈉是由兩個(gè)重復(fù)羧基化單糖單元組成的多糖主鏈，其結(jié)構(gòu)中含有羧基和羥基[9]。然而，由于現(xiàn)有的羧基和羥基在發(fā)酵過(guò)程中可以結(jié)合過(guò)量的水，這會(huì)顯著降低其機(jī)械強(qiáng)度。固定化顆粒的軟化和分解會(huì)影響細(xì)胞固定化的效率，導(dǎo)致生物發(fā)酵性能降低。在不影響生物相容性的情況下，通過(guò)化學(xué)改性引入更強(qiáng)的聚合物主鏈等方法可提高固定化材料的機(jī)械強(qiáng)度。如Zhang等[10]為了解決天然聚合物材料機(jī)械強(qiáng)度較低的問(wèn)題，在海藻酸中加入適量的殼聚糖或Al2O3制備了新的細(xì)胞固定化載體，避免了海藻酸凝膠的分解、軟化和漂浮問(wèn)題。吳亞杰等[11]在海藻酸凝膠球中添加無(wú)機(jī)材料粉末活性炭、SiO2、CaCO3和人造沸石，改善海藻酸凝膠球的機(jī)械強(qiáng)度。其中添加粉末活性炭能提高凝膠球的壓縮強(qiáng)度；添加SiO2能提高凝膠球的密度；添加CaCO3能提高凝膠球的傳質(zhì)性能；添加人造沸石能提高凝膠球的抗拉強(qiáng)度。

1.1.2 人工合成有機(jī)高分子載體材料

人工合成有機(jī)高分子載體材料是人工合成的具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料，常見(jiàn)的有聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚氨基酸和聚乙烯醇等（見(jiàn)表2）。它們的特點(diǎn)是抗微生物分解性好、機(jī)械強(qiáng)度高和穩(wěn)定性強(qiáng)等。其中，聚酰胺基質(zhì)的多孔珠狀材料可用于丙酸桿菌（Propionibacteriumsp.）的固定化，并提高了以葡萄糖為底物生產(chǎn)丙酸的發(fā)酵性能[14]。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵無(wú)滯后期，在底物濃度為40g/L 時(shí)，丙酸產(chǎn)量提高了26.5%。聚酰胺是分子主鏈上含有酰胺基團(tuán)的高分子化合物，氫鍵的存在使其具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。在重復(fù)發(fā)酵過(guò)程中，微珠在攪拌和酸性條件下都具有很高的穩(wěn)定性，且與細(xì)胞結(jié)合的微珠即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的保存也能繼續(xù)作為接種劑，這在細(xì)胞保存方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。但缺少聚酰胺材料促進(jìn)細(xì)胞吸附的自由官能團(tuán)，細(xì)胞不能更好的吸附，可通過(guò)聚陽(yáng)離子聚醚酰亞胺（PEI）進(jìn)行微珠的修飾，以增強(qiáng)聚酰胺材料與細(xì)胞的電荷相互作用。F127-甲基丙烯酸雙脲酯（F127-BUM）水凝膠在單細(xì)胞培養(yǎng)和多細(xì)胞共培養(yǎng)中可重復(fù)使用，并具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性（見(jiàn)圖2）[15]。在單細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，負(fù)載S.cerevisiae的水凝膠在以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇時(shí)，長(zhǎng)達(dá)一年的過(guò)程中，所有菌株生物發(fā)酵仍可運(yùn)行，表明這些水凝膠材料具有較好的穩(wěn)定性[15]。在多細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，上游大腸桿菌（Escherichia coli）可利用葡萄糖合成中間體3，4-二羥基苯丙氨酸，該中間體隨后被下游釀酒酵母（S.cerevisiae）代謝轉(zhuǎn)化為甜菜黃素[15]。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，在5 次重復(fù)使用后，固定化細(xì)胞仍保持了100%的甜菜黃素產(chǎn)量，而游離體系很快失去了產(chǎn)生甜菜黃素的能力。水凝膠固定化細(xì)胞的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于能夠通過(guò)改變細(xì)胞裝載凝膠的比例來(lái)控制所需的細(xì)胞組成，從而解決生物合成能力不平衡的問(wèn)題。例如，在E. coli/S.cerevisiae的共培養(yǎng)體系中，不同菌株的生長(zhǎng)速率和底物代謝能力不同，這會(huì)導(dǎo)致菌群的結(jié)構(gòu)和比例難以有效調(diào)節(jié)，導(dǎo)致微生物共培養(yǎng)系體的穩(wěn)定性和可控性差。通過(guò)水凝膠固定化細(xì)胞技術(shù)，可在空間上控制不同菌株，如E.coli∶S.cerevisiae為1∶6時(shí)，空間上調(diào)控共培養(yǎng)體系中不同微生物菌株的比例可將甜菜黃素的產(chǎn)量提高100%[15]。

表2 利用人工合成高分子材料固定細(xì)胞進(jìn)行生物發(fā)酵

細(xì)胞固定化技術(shù)也可與3D打印技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。例如，利用F127-二甲基丙烯酸酯（F127-DMA）作為包埋材料，3D 打印機(jī)可打印一種多功能響應(yīng)的包埋酵母的水凝膠。聚合物水凝膠對(duì)溫度和壓力的可逆刺激響應(yīng)可使酵母細(xì)胞與水凝膠更易于結(jié)合，且印刷聚合物水凝膠的后續(xù)光交聯(lián)可使水凝膠更加堅(jiān)固。在連續(xù)批次發(fā)酵過(guò)程中，這些酵母負(fù)載的活性物質(zhì)在葡萄糖發(fā)酵成乙醇的過(guò)程中具有更好的代謝性能，且乙醇的收率維持在90%以上[16]。該細(xì)胞固定化平臺(tái)技術(shù)也可適用于其他工業(yè)菌株，以實(shí)現(xiàn)利用連續(xù)生物發(fā)酵合成其他高價(jià)值的化學(xué)品或生物燃料等。

1.2 無(wú)機(jī)載體材料在生物發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

無(wú)機(jī)載體材料由無(wú)機(jī)物單獨(dú)或混合其他物質(zhì)制成，如多孔硅、活性炭和氧化鋁等（見(jiàn)表3）。材料多為多孔結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的吸附能力和靜電引力，可將細(xì)胞吸附到載體表面，細(xì)胞吸附過(guò)程反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單且載體可反復(fù)利用。活性炭因其無(wú)毒、吸附性能和力學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[23]。活性炭由于密度較低，在發(fā)酵液中具有良好的流動(dòng)性，能更有效地捕獲細(xì)胞。以活性炭多孔顆粒載體對(duì)丙酮丁酸梭菌（C.acetobutylicum）進(jìn)行固定化生物發(fā)酵為例，細(xì)胞濃度、碳源消耗速率、產(chǎn)氫氣量和丁醇產(chǎn)量都得到了顯著提高[24]。據(jù)報(bào)道，在C. acetobutylicum固定化發(fā)酵過(guò)程中，大多數(shù)參與編碼氫化酶、NADH-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶和鐵氧化還原蛋白的基因（hydGEF、hydA1、hydA2、fhuBDC、CA_P0141-CA_P0142）在基因表達(dá)強(qiáng)度上均得到上調(diào)[25]。

圖2 使用微生物單細(xì)胞培養(yǎng)和多細(xì)胞共培養(yǎng)負(fù)載水凝膠進(jìn)行生物發(fā)酵

表3 利用無(wú)機(jī)材料固定細(xì)胞進(jìn)行生物發(fā)酵

生物炭是生物質(zhì)在有限氧條件下進(jìn)行熱化學(xué)轉(zhuǎn)化而得到的一種具有碳質(zhì)、多孔和穩(wěn)定的材料。由于高溫?zé)峤猓锾恐行纬闪素S富的獨(dú)特微孔結(jié)構(gòu)，具有較高的吸附和吸水能力。此外，官能團(tuán)、礦物質(zhì)和金屬也會(huì)引起生物炭堿度的變化，使生物炭具有較強(qiáng)的pH 緩沖能力、陽(yáng)離子交換能力和電導(dǎo)率[26]。此外，生物炭表面富含官能團(tuán)和較高的結(jié)晶度，這也可幫助促進(jìn)生物膜的形成和電子轉(zhuǎn)移[27]。生物膜的形成進(jìn)一步為微生物細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)內(nèi)部保護(hù)環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)不利環(huán)境脅迫的耐受性[28]。例如，利用生物炭固定的C. beijerinckiiF-6對(duì)丁醇的耐受性顯著提高，且丁醇的生產(chǎn)效率也得到了提高。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，丁醇和產(chǎn)氫氣速率分別達(dá)到0.148g/(L·h)和0.299mmol/(L·h)，分別比對(duì)照組提高20.23%和48.76%[27]。另一個(gè)有趣的現(xiàn)象是生物炭還可以促進(jìn)細(xì)胞之間的電子轉(zhuǎn)移，從而調(diào)節(jié)厭氧微生物菌群揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)物的分布[29]。

1.3 復(fù)合載體材料在生物發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

復(fù)合載體材料為了改善生物材料的本體或表面性質(zhì)，由不同材料結(jié)合而成（見(jiàn)表4）。復(fù)合載體材料有利于材料性能優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，具備良好的生物相容性、較高的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)。聚乙烯醇（PVA）中的羥基和海藻酸鹽中的羧基通過(guò)酯化反應(yīng)形成共價(jià)鍵，從而彌補(bǔ)使用單一聚合物固定化載體的缺點(diǎn)，膜的機(jī)械強(qiáng)度得到了提高[33]，而且可從兩種聚合物中優(yōu)化提取出最佳的膜。用PVA/海藻酸鈣混合物可形成優(yōu)良的微球，再采用“凍融”技術(shù)將鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）固定在微球中進(jìn)行乳酸生物發(fā)酵[34]，乳酸的產(chǎn)量達(dá)到理論值的97.6%。與游離細(xì)胞相比，還原糖消耗提高了36.9%，乳酸的產(chǎn)量提高了37.1%，達(dá)到17.6g/L。從力學(xué)性能上看，PVA/海藻酸鈣微珠表現(xiàn)出較強(qiáng)的力學(xué)特性，固定化細(xì)胞有較高的機(jī)械穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，成功地應(yīng)用于連續(xù)7個(gè)循環(huán)的分批發(fā)酵，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞活力和較穩(wěn)定的乳酸產(chǎn)量[34]。

復(fù)合材料作為細(xì)胞固定化載體可以制備更大的可控制尺寸。木質(zhì)纖維素基質(zhì)可制備成納米和微米尺度的多孔的纖維素材料，其中微生物細(xì)胞可以進(jìn)入形成的空腔，通過(guò)靜電和物理吸附固定。為提高乳清發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的速率，提出了使用各種管狀纖維素和管狀纖維素/海藻酸鹽/聚乳酸復(fù)合材料作為實(shí)驗(yàn)室固定化載體[35]。聚乳酸的使用是為了降低纖維素中微管的尺寸，其中的復(fù)合材料有望提高細(xì)胞在凝膠基質(zhì)中的存活率。例如，以芒果提取的木質(zhì)纖維素/海藻酸鈣/聚乳酸復(fù)合材料作為保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus）的固定化載體時(shí)，可促進(jìn)乳糖培養(yǎng)基中乳酸發(fā)酵，獲得更高的乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度[35]。與游離細(xì)胞相比，乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了36.4%和36.5%。

2 高分子膜材料在生物發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 中空纖維膜

中空纖維膜作為固定化材料，與海藻酸鹽等傳統(tǒng)有機(jī)載體材料相比，具有機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。管狀中空纖維為細(xì)胞封裝提供了高的表面積和孔隙率，因此具有更高的底物擴(kuò)散和傳質(zhì)速率。中空纖維膜等聚合物載體上的細(xì)胞固定化還具有其他優(yōu)點(diǎn)：①較高的細(xì)菌密度和生產(chǎn)力；②連續(xù)運(yùn)行，無(wú)細(xì)胞沖刷問(wèn)題；③抑菌化合物接觸量低；④細(xì)胞的長(zhǎng)期再生和再利用[38]。基于膜的固定化不需要任何共價(jià)交聯(lián)或離子鍵，細(xì)胞可以簡(jiǎn)單地在膜壁內(nèi)外擴(kuò)散。此外，可以在固定化過(guò)程之前制備膜，從而在不影響細(xì)胞活力和生產(chǎn)力的前提下，更靈活地設(shè)計(jì)中空纖維膜的結(jié)構(gòu)。例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）可固定在中空纖維膜生物反應(yīng)器（immobilized cell hollow fiber membrane bioreactor，ICHFMB）中，從而減輕木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的抑制劑在乙醇生物發(fā)酵過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的毒害作用[39]，并在高抑制劑濃度條件下達(dá)到理論乙醇產(chǎn)量的95%。且細(xì)胞在膜內(nèi)的固定也非常穩(wěn)定，ICHFMB 在相同條件下可實(shí)現(xiàn)連續(xù)20 次運(yùn)行。眾所周知，木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的抑制劑（糠醛、乙酸、5-羥甲基糠醛、香蘭素、丁香醛、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛等）會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，而同時(shí)暴露在多個(gè)抑制劑下對(duì)細(xì)胞的毒害作用更加明顯。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定在中空纖維膜上的細(xì)胞因膜屏障作用，即使在水解抑制劑存在情況下，仍能表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)和葡萄糖攝取速率[39]。在此發(fā)酵過(guò)程中，水解抑制劑可從膜孔緩慢的釋放，這可使固定化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌逐漸適應(yīng)水解抑制劑，具有更好的耐受性。ICHFMB在細(xì)胞固定化過(guò)程中具有很大的靈活性，通過(guò)改變水解液流量和膜表面積，可以提高生物發(fā)酵的性能。通過(guò)將細(xì)胞固定在不同的中空纖維膜組件上，可建立細(xì)胞與發(fā)酵液、細(xì)胞與細(xì)胞空間上的分離（見(jiàn)圖3）。同時(shí)浸沒(méi)式中空纖維膜生物反應(yīng)器（submerged hollow fiber membrane bioreactor，SHFMB）可改善自由細(xì)胞體系木糖消耗速率較低的問(wèn)題[40]。懸浮的Z.mobilis和木糖發(fā)酵菌（Cheffersomyces stipitis）在共培養(yǎng)中因?yàn)榈孜铩a(chǎn)物和分解代謝物的抑制作用，在以葡萄糖和木糖混合物作為底物進(jìn)行發(fā)酵中表現(xiàn)出較差的木糖利用。將細(xì)胞分別固定在中空纖維膜組件上，使兩者達(dá)到了空間分離的狀態(tài)，可顯著提高細(xì)胞的魯棒性，有效改善細(xì)胞浸沒(méi)式中空纖維膜（SHFMB）固定細(xì)胞的木糖利用效率。與游離細(xì)胞共培養(yǎng)相比，在總糖濃度為120g/L 時(shí)，木糖消耗量從3%提高到70%，且固定化細(xì)胞在連續(xù)12批生物發(fā)酵后，其發(fā)酵性能仍保持穩(wěn)定[40]。

表4 利用復(fù)合材料固定細(xì)胞進(jìn)行生物發(fā)酵

浸沒(méi)式中空纖維膜生物反應(yīng)器（submerged hollow-fiber membrane bioreactors，s-HF/MBRs）可應(yīng)用在多細(xì)胞體系的生物發(fā)酵過(guò)程中，克服多細(xì)胞培養(yǎng)體系中菌株生長(zhǎng)特征不同、產(chǎn)物抑制和底物競(jìng)爭(zhēng)等問(wèn)題[41]。該體系中，上游酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）在A反應(yīng)器利用蔗糖合成中間體丁酸鹽，該中間體隨后被蠕動(dòng)泵運(yùn)輸?shù)紹 反應(yīng)器后被下游巨型球菌（Megasphaera hexanoica）吸收轉(zhuǎn)化為己酸（見(jiàn)圖4）。利用s-HF/MBRs 反應(yīng)器合成己酸的濃度可升高至10.08g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.69g/(L·h)。該研究為首次在浸沒(méi)式中空纖維膜生物反應(yīng)器中利用微生物共培養(yǎng)體系發(fā)酵合成己酸[41]。

2.2 微米/納米纖維膜

圖3 利用中空纖維膜模塊對(duì)微生物進(jìn)行分離和多細(xì)胞共培養(yǎng)生物生產(chǎn)

圖4 浸沒(méi)式中空纖維膜裝置

近年來(lái)，微米/納米尺度材料吸引了廣泛的關(guān)注。由于其具有較大的表面積與體積比，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高負(fù)載。微米級(jí)材料和納米級(jí)材料的精細(xì)多孔結(jié)構(gòu)可使底物更易于擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，并且其低擴(kuò)散阻力使發(fā)酵具有更高的反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率。此外，與顆粒相比，它們更容易從反應(yīng)介質(zhì)中回收，具有良好的連續(xù)操作性能。例如，利用聚丙稀微纖維膜作為載體材料固定化琥珀酸放線桿菌（Actinocacillus succinogenes），以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程中，琥珀酸的收率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)0.82g/g 和1.04g/(L·h)[42]。同時(shí)，采用補(bǔ)料間歇策略可進(jìn)一步構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的微纖維膜生物反應(yīng)器。為了使細(xì)菌能更好地固定在微纖維膜材料上，可對(duì)纖維膜進(jìn)行電暈處理使其膜上帶正電，進(jìn)而可使帶負(fù)電的細(xì)胞通過(guò)靜電作用更好地固定在聚丙烯微纖維膜上。此外，細(xì)胞固定化膜具有良好的再利用穩(wěn)定性，在發(fā)酵多個(gè)循環(huán)后無(wú)活性損失[42]。介孔載體與工業(yè)生物技術(shù)的相互結(jié)合，為工業(yè)菌株在生物發(fā)酵體系中的可重復(fù)利用提供了更廣闊的前景。

電紡納米纖維膜作為組織工程的候選材料，可以模擬天然的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），在過(guò)去幾十年中得到了廣泛的研究。電紡納米纖維膜具有高孔隙率和疏松的三維多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可以模擬自然的ECM結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞固定提供載體[43]。細(xì)胞對(duì)局部的微米尺度、亞微米尺度和納米尺度的表面形貌天生敏感[44]，表面形貌的改變會(huì)引發(fā)不同的細(xì)胞行為，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞定位、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性和基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變。因此，電紡納米纖維膜是一種極好的細(xì)胞黏附、增殖和表達(dá)基質(zhì)成分的候選材料。已有研究將電紡醋酸納米纖維作為L(zhǎng).plantarum生物膜形成的載體材料。納米纖維膜被證明是細(xì)菌生物膜的良好載體，具有很高的穩(wěn)定性[45]，在整個(gè)可重復(fù)使用批次中，發(fā)酵液中的活細(xì)胞約為11 lg(CFU/g)，比標(biāo)準(zhǔn)值高出4 lg(CFU/g)，生物膜與納米纖維形成一個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，生物膜固定化發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)間縮短2.8h，21天后植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的存活率比以浮游細(xì)菌高36 倍[45]。微米/納米纖維膜是生物技術(shù)和發(fā)酵工程中固定化細(xì)菌生物膜的理想載體材料，在微生物學(xué)和發(fā)酵工程中有著巨大的應(yīng)用前景。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

與傳統(tǒng)的固定化材料相比，新型高分子多孔膜材料介導(dǎo)的細(xì)胞固定化技術(shù)在生物發(fā)酵領(lǐng)域展示出巨大的應(yīng)用潛力。近幾年，隨著聚合物合成技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多性能優(yōu)良的新型聚合物載體被開(kāi)發(fā)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞固定化技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。目前，在生物發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)用最廣泛的膜生物反應(yīng)器還局限在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的應(yīng)用，不具有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用能力。新型高分子多孔膜材料介導(dǎo)的細(xì)胞固定化技術(shù)將極大地提高細(xì)胞密度和固定化細(xì)胞的性能，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，越來(lái)越多的研究報(bào)道了利用人工混菌體系合成有用化學(xué)品和生物燃料，這也是生物發(fā)酵領(lǐng)域中重要的研究方向之一。人工混菌體系可通過(guò)勞動(dòng)分工完成復(fù)雜工作，如木質(zhì)纖維素的直接降解轉(zhuǎn)化、長(zhǎng)代謝路徑化學(xué)品的合成等，且人工混菌體系處在動(dòng)態(tài)平衡的一種狀態(tài)，這使微生物對(duì)復(fù)雜環(huán)境具有更好的適應(yīng)性。然而由于不同微生物之間存在底物利用競(jìng)爭(zhēng)、營(yíng)養(yǎng)需求條件的不同，如氧氣、pH 和水解抑制劑毒害等，人工混菌體系的穩(wěn)定性和可控性仍存在巨大挑戰(zhàn)。通過(guò)膜材料介入構(gòu)建有氧和厭氧的真菌-細(xì)菌共培養(yǎng)體系，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)直接利用木質(zhì)纖維素合成乳酸等有用化學(xué)品[46]，這也為進(jìn)一步構(gòu)建和設(shè)計(jì)具有可控性和魯棒性的人工混菌體系提供了借鑒，如可以根據(jù)菌體的大小、菌體電荷不同設(shè)置梯度膜和不同電荷性質(zhì)的膜材料，從而設(shè)計(jì)與構(gòu)建細(xì)菌-酵母或者表面帶正電荷-負(fù)電荷菌的共生體系，從而進(jìn)一步提高人工混菌體系的魯棒性和穩(wěn)定性。

材料介導(dǎo)細(xì)胞固定化技術(shù)為工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域提供了新的啟發(fā)。固定化細(xì)胞載體材料的性質(zhì)和固定化過(guò)程是生物發(fā)酵性能的關(guān)鍵。因此，在選擇固定載體材料時(shí)需要全方面考慮材料的性能，如力學(xué)性能、穩(wěn)定性和粗糙度等。材料介導(dǎo)的細(xì)胞固定化技術(shù)已被證明可有效提高固定化細(xì)胞在復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性和生長(zhǎng)代謝性能。在未來(lái)，具有制備工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)及可連續(xù)操作的細(xì)胞固定化技術(shù)將在生物發(fā)酵領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。