甲基化轉移酶樣蛋白3在急性心肌梗死患者外周血中的表達及對缺氧缺血所致心肌細胞損傷的調節作用▲

周 鈺 白峰華 張 君 詹 峰 董小莉 吳 奎

(海南省人民醫院1 入院服務中心，2 科教處，3 急診ICU病房，4 心血管內科，?？谑?570311，電子郵箱：zho38763@163.com；5 海南醫學院基礎醫學與生命科學學院，海口市 571199)

心肌梗死是全球人類死亡的主要原因之一。急性心肌梗死的特點是冠狀動脈突發性缺血缺氧，引起心肌細胞凋亡、壞死，從而導致不可逆的心肌組織損傷[1-2]。盡管已有研究報告了多種信號通路參與心肌細胞凋亡，包括活性氧、蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB信號通路等[3-5]，但心肌梗死以及其他與缺氧缺血相關的急性心臟疾病的分子機制仍不完全清楚。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是真核mRNA中最普遍的內部修飾[6]。盡管m6A修飾存在于成千上萬個具有獨特分布模式的RNA轉錄物[7]，但其在大多數RNA修飾中的功能仍然未知。在哺乳動物細胞中，m6A的修飾可被甲基化轉移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3和METTL14等甲基轉移酶復合物催化[8]。而且METTL3在哺乳動物中發揮著多種生物學功能，例如調節胚胎干細胞分化、轉錄剪接、控制蛋白質翻譯等[9-11]。研究表明，METTL3可調節缺血再灌注小鼠心肌細胞的自噬和凋亡[12]，但其對急性缺血缺氧的人心肌細胞損傷的調節效果仍不清楚。本研究探討m6A-METTL3在心肌梗死患者體內的表達情況，以及對缺氧/缺血(hypoxia/ischemia，HI)心肌細胞凋亡和自噬的影響，并分析METTL3在急性心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年1月至2019年12月于我院診治的60例急性心肌梗死患者(心肌梗死組)的外周血樣本。心肌梗死組的納入標準：(1)符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[13]的診斷標準；(2)患者發病后5 h內入院。心肌梗死組的排除標準：(1)肝、腎功能障礙者；(2)近6個月有手術史及重大創傷史者；(3)瓣膜性疾病、急性腦血管疾病患者；(4)自身免疫性疾病、血液系統疾病患者；(5)合并其他可能影響本研究結果的疾病者。心肌梗死組中男性35例、女性25例，年齡35～77(53.93±3.69)歲。另從我院體檢中心收集同期60例健康體檢者(健康對照組)的外周血。健康對照組的納入標準：未患明顯疾病(如特異性感染、骨骼疾病、腫瘤、心臟疾病等疾病)的健康成年人。健康對照組的排除標準：肥胖、殘疾、精神疾病、腫瘤、結核病以及患其他系統疾病者。健康對照組中男性36例、女性24例，年齡32～79(52.91±3.82)歲，兩組研究對象的年齡和性別比例差異均無統計學意義(均P>0.05)。本研究經我院醫學倫理委員會批準，并獲得所有患者和體檢者的知情同意。

1.2 血液標本的采集和處理 收集心肌梗死患者入院4 h內的血液標本4 mL，及健康對照組體檢抽血后4 h內的余血標本4 mL。使用抗凝管(肝素抗凝)獲得血漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，獲取血清。血清和血漿分別置于1.5 mL的EP管中，保存于-20℃環境中待檢。

1.3 試劑與耗材 TRIzol試劑盒購于美國英杰公司(批號：15596-026)；PrimeScriptTMRT Master Mix和LipofecamineTM2000試劑盒購于德國Eurofins MWG Operon公司(批號：PKD446、200917003)；人心肌細胞AC16購于通派(上海)生物科技有限公司并經專業認證資源鑒定通過。SYBR qPCR Mix和細胞計數試劑8(cell counting kit-8，CCK-8)均購于日本TaKaRa公司(批號：201719001)；磷酸酶檢測試劑盒購于中國建城生物工程公司(批號：06104008A)。二辛可寧酸試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：02093011X)。聚偏二氟乙烯膜購于美國Millipore公司(批號：15630002)。METTL3酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司(批號：201651002)。溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1(批號：ab120497)、兔抗人METTL3(批號：ab195352)、激活型天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-Caspase3；批號：ab32042)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號：ab182858)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax；批號：ab32503)、微管相關蛋白1輕鏈3B-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ；批號：ab232940)、自噬通量減少的標志物人死骨片1(sequestosome 1，SQSTM1；批號：ab109012)的第一抗體和第二抗體(批號：ab150077)均購于美國Abcam公司。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的構建和合成均由上海吉瑪公司完成。

1.4 細胞培養和HI細胞模型的構建和處理 將AC16細胞在37℃和5% CO2的條件下培養于含5%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(100 μg/mL)的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)中，24 h換液一次，48～36 h傳代一次。將傳代后的對數期AC16細胞分為5組，包括對照組、HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組、siNC+HI-2h組。對照組AC16細胞不進行任何處理。HI-2h組、HI-4h組AC16細胞分別進行2 h和4 h的低血清(1%胎牛血清)和低氧(1% O2、5% CO2、94% N2)的HI處理。siMETTL3+HI-2h組AC16細胞在經siMETTL3(有效沉默METTL3的siRNA序列)轉染24 h后進一步行HI處理2 h。siNC+HI-2h組AC16細胞在siNC(siMETTL3的陰性對照序列)轉染24 h后進一步行HI處理2 h。在檢測AC16細胞自噬通量蛋白的實驗中，將終濃度為50 nmol/L的溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1添加到DMEM中，其余處理方式不變，檢測自噬標記蛋白水平。

1.5 熒光定量PCR檢測血漿METTL3 mRNA相對表達水平 使用TRIzol試劑盒提取兩組研究對象血漿中的總RNA，并使用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。根據PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒的操作說明，在以下反應條件下合成cDNA：40℃持續6 min，65℃持續25 min。將cDNA產物儲存在-80℃冰箱中，用于定量PCR。反應體系為20 μL：2 μL cDNA產物，0.4 μL 50×ROX，10 μL SYBR qPCR Mix，0.8 μL上游引物和0.8 μL下游引物，補充RNase水至20 μL。反應條件：首先在95℃下預變性1 min，隨后進行以下反應：95℃下變性30 s，60℃退火40 s，總共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，每個實驗設置3個復孔，并將所有樣品重復3次。采用2-ΔΔCt計算METTL3 mRNA的相對表達水平。所有操作均在冰上進行。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 ELISA法檢測血清METTL3表達水平 使用ELISA法檢測兩組研究對象外周血清METTL3表達水平，操作方法嚴格按照劑盒說明書進行。

1.7 CCK-8法測定AC16細胞增殖率 取1.4中分組處理后的AC16細胞，將其以每孔1×103個的密度重新接種到96孔板中，使用含5%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM在37℃和5% CO2的條件下培養0、12、24、48 h。將CCK-8試劑以10%的最終濃度添加到每個孔中，避光孵育1 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值。細胞增殖率=(觀察組吸光度值-空白管吸光度值)/(陰性對照組吸光度值-空白管吸光度值)×100%。

1.8 流式細胞儀檢測AC16細胞凋亡率 取1.4中分組處理后的AC16細胞，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，5 min/次，并使用1 mL流式緩沖溶液重懸細胞使細胞密度為1×106/mL。將100 μL細胞懸液添加到5 mL流量管中，隨后添加10 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素染色和10 μL碘化丙錠染色，避光、室溫下孵育15 min。采用流式細胞儀(美國安捷倫生物科技有限公司)檢測細胞凋亡率。

1.9 免疫印跡法檢測蛋白表達水平 取1.4中分組處理后的AC16細胞，加入200 μL M-PERTM裂解液(美國賽默飛公司，批號：78503)，冰上裂解30 min，1 500 r/min離心10 min取上清。根據二辛可寧酸法測定蛋白的濃度。在變性條件下，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離20 μg總蛋白，并將其轉移至聚偏二氟乙烯膜。將膜封閉在5%脫脂牛奶中，隨后給予抗METTL3(1 ∶600)、cleaved-Caspase3(1 ∶800)、Bax(1 ∶700)、Bcl-2(1 ∶400)、LC3B-Ⅱ(1 ∶600)、SQSTM1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶5 000)的一抗4℃孵育過夜，并使用Tris緩沖鹽溶液和Tween 20洗滌膜。隨后將膜與二抗(1 ∶2 000)在室溫下孵育2 h，并用Tween 20洗滌。通過使用增強的電化學發光試劑可以觀察到蛋白條帶。以GAPDH為內參蛋白，使用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.10 統計學分析 使用GraphPad Prism軟件(5.0版)進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示。多組間的比較采用方差分析，其中兩兩比較使用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象血漿METTL3 mRNA的相對表達水平、血清METTL3表達水平的比較 心肌梗死組血漿METTL3 mRNA相對表達水平、血清METTL3表達水平均高于健康對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血漿METTL3 mRNA相對表達水平、血清METTL3表達水平的比較(x±s)

2.2 敲低METTL3對體外急性HI心肌細胞增殖的影響 培養0 h時，5組細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05)。培養12 h、24 h、48 h時，HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h、siNC+HI-2h組細胞增殖率均低于對照組(P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組細胞增殖率均高于HI-2h組、siNC+HI-2h組(均P<0.05)。見表3。

表3 5組AC16細胞增殖率的比較(x±s，%)

2.3 敲低METTL3對體外急性HI心肌細胞凋亡的影響 (1)HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組AC16 細胞的凋亡率高于對照組(均P<0.05)，而siMETTL3+HI-2h組與對照組的凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。siMETTL3+HI-2h組AC16細胞凋亡率低于siNC+HI-2h組和HI-2h組(均P<0.05)。見表4和圖1。(2)與對照組比較，HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組的cleaved-Caspase3表達水平，以及HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組、siNC+HI-2h組的Bax/Bcl-2 比值均升高(均P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組與對照組的cleaved-Caspase3表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；siMETTL3+HI-2h組cleaved-Caspase3表達水平和Bax/Bcl-2比值均低于HI-2h組和siNC+HI-2h組(P<0.05)。見表5和圖2。

表4 5組AC16細胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組AC16細胞凋亡率檢測結果

2.4 敲低METTL3對體外急性HI心肌細胞METTL3蛋白表達水平的影響 HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組的METTL3蛋白表達水平均高于對照組(均P<0.05)，但siMETTL3+HI-2h組與對照組差異無統計學意義(均P>0.05)。HI-4h組的METTL3蛋白表達水平高于HI-2h組(P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組的METTL3蛋白表達水平低于HI-2h組和siMETTL3+HI-2h組(均P<0.05)。見表6和圖2。

表6 5組AC16細胞METTL3蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖2 5組細胞各蛋白表達情況

2.5 敲低METTL3對體外急性HI心肌細胞自噬通量的影響 與對照組相比，HI-2h組、HI-4h組及siNC+HI-2h組的LC3B-Ⅱ表達水平均下調，而HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組以及siNC+HI-2h組SQSTM1表達水平均上調(均P<0.05)；與HI-2h組比，HI-4h組的SQSTM1表達水平上調(均P<0.05)；與HI-2h組和siNC+HI-2h組比，siMETTL3+HI-2h組的LC3B-Ⅱ表達水平上調，而SQSTM1表達水平下調(均P<0.05)。見表7和圖2。

表7 5組AC16細胞自噬通量相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

本研究結果顯示，心肌梗死組血漿中METTL3的mRNA相對表達水平均高于健康對照組(P<0.05)，提示心肌梗死的發生可能與METTL3的表達有關。

盡管METTL3介導的m6A修飾具有重要的生物學意義，然而，目前對METTL3如何調節細胞功能和基因的表達的研究仍較少。本研究中， siMETTL3+HI-2h組細胞增殖率均高于HI-2h組、siNC+HI-2h組(P<0.05)，提示沉默METTL3的表達可以恢復HI心肌細胞的增殖，這也表明METTL3可能參與調節HI誘導的心肌細胞增殖抑制。另外，研究表明HI還可以通過誘導心肌細胞凋亡促進心肌細胞損傷[5]。cleaved-Caspase3和Bax/Bcl-2比值是心肌細胞凋亡的關鍵標志物[14]。本研究中，與對照組比較，HI-2h組和HI-4h組的心肌細胞的增殖率均降低，METTL3蛋白表達水平、細胞凋亡率、cleaved-Caspase3水平和Bax/Bcl-2比值均增加(P<0.05)，提示METTL3可能參與調節HI誘導的心肌細胞的凋亡和增殖抑制。Song等[12]的研究表明，過表達METTL3可以促進心肌細胞的凋亡，使用短發夾RNA敲低METTL3表達后，缺氧復氧模型小鼠心肌細胞的凋亡明顯降低。本研究使用siRNA技術敲低METTL3的表達，結果顯示，與HI-2h組和siNC+HI-2h組比較，siMETTL3+HI-2h組AC16細胞凋亡率、cleaved-Caspase3表達水平和Bax/Bcl-2比值均降低(P<0.05)，表明沉默METTL3表達可以抑制HI誘導的心肌細胞凋亡。

SQSTM1蛋白是自噬通量減少的標志物，LC3B-Ⅱ蛋白是自噬標志物[15]。研究顯示，在體內和體外抑制細胞自噬，能引起細胞凋亡的增加[16]?；诒狙芯坑^察到的沉默METTL3表達對心肌細胞凋亡的影響，進一步檢測了HI及沉默METTL3對心肌細胞自噬標記物和自噬通量的影響。結果顯示，HI-2h組和HI-4h組AC16心肌細胞的LC3B-Ⅱ蛋白表達水平低于對照組，而SQSTM1蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)；當敲低METTL3表達后HI心肌細胞LC3B-Ⅱ蛋白的表達增加，而SQSTM1蛋白的表達降低(P<0.05)。以上結果與既往研究[17]相似，提示METTL3具有抑制心肌細胞自噬的作用，而敲低METTL3可以上調HI誘導的心肌細胞損傷的細胞自噬通量。自噬信號通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)-1的下游轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)在轉錄水平對細胞自噬具有關鍵調控作用[18]，而有研究表明過表達METTL3可以明顯抑制TFEB表達，從而抑制心肌細胞的自噬水平，而敲低METTL3可通過上調內源性TFEB水平來抑制mTOR的磷酸化，從而促進自噬[19]，且TFEB已被證明可抑制mTOR活性[20]。以上結果表明METTL3是心肌細胞自噬的負調控因子。

綜上所述，m6A甲基化轉移酶METTL3在心肌梗死患者體內和HI誘導的急性心肌細胞損傷模型中的表達均升高，沉默METTL3可以抑制HI心肌細胞的凋亡并增加自噬通量，促進細胞增殖的恢復。METTL3或可作為急性缺血缺氧性疾病的潛在診斷和治療靶點。