食品中4，4’-二硝基均二苯脲殘留量的 前處理方法比較

◎ 譚美齡，蔣忠岑

（重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）

4，4’-二硝基均二苯脲（DNC）是抗球蟲藥尼卡巴嗪的殘留標志物和抗球蟲效果的主要活性成分[1]，長期攝入尼卡巴嗪含量超標的食品會對身體產生危害。本文分別采用Oasis?PRiME HLB固相萃取法[2]、國家標準方法GB/T 29690—2013[3]以及QuEChERS法[4]對雞蛋和雞肉進行前處理，采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）對DNC的殘留量進行測定[5]。從凈化效果、目標物損失情況、基質效應、回收率及精密度和實際應用能力這幾個方面對DNC的3種前處理方法的適用性進行了比較，為尼卡巴嗪的相關分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、雞肉，采樣于超市和農貿市場。

標準物質：DNC（Lot：C0005423，純度為99.7%），北京曼哈格；DNC-D8（Lot：30213203，純度為99.7%），德國WITEGA。

甲醇、乙腈（均為色譜純），德國Merck公司；正己烷、無水硫酸鈉等（均為國產分析純），重慶川東化工公司；CNW?PSA（硅膠鍵合乙二胺基-N-丙基）、CNW?LC-C18（硅膠鍵合十八烷基40～63 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DIONEX UltiMate-3 000液相色譜系統-串聯TSQ Quantum Access Max三重四極桿質譜儀（配ESI離子源），美國Thermo Fisher Scientific公司；SIGMA 3-15型臺式高速離心機，德國SIGMA實驗室離心機公司；Reeko AutoEVA-60全自動平行濃縮儀，睿科集團股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取DNC標準物質0.010 02 g置于10 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺溶解配制成DNC標準儲備溶液（998.994 μg·mL-1）；稱取 DNC-D8標準物質 0.010 00 g置50 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺配制成DNC-D8標準儲備溶液（199.4 μg·mL-1）。分別移取上述溶液，用甲醇稀釋成DNC標準工作溶液（998.994 ng·mL-1）和DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1）。按照最終定容內標濃度為 100 ng·mL-1，外標濃度為 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1、80 ng·mL-1和 100 ng·mL-1，采用 75% 甲醇水溶液進行稀釋配制。

1.3.2 樣品制備

（1）方法1。采用GB 29690—2013方法，其中加入 10 μL DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1），最終用75%甲醇水溶液復溶至1 mL。

（2）方法2。稱取2 g樣品，加入100 μL DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1）和10 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混合1 min，超聲10 min，8 000 r·min-1離心10 min。取4 mL上清液過Oasis?PRiME HLB（6 mL，200 mg）小柱，收集濾液并吸取1 mL于氮氣下（＜40 ℃）吹至近干，將殘余物用75%甲醇水溶液復溶至1 mL。

（3）方法3。稱取2 g樣品，加入4 mL水，渦旋混合1 min。加入100 μL DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1）和 10 mL 乙腈，渦旋混合 30 s。加入4 g硫酸鎂（MgSO4）及陶瓷子，渦旋混合1 min，8 000 r·min-1離 心 10 min。 取 3 mL 上 清 液， 加 入400 mg MgSO4、70 mg PSA、20 mg C18，渦旋混合1 min，8 000 r·min-1離心 5 min。取 1 mL 上清液于氮氣下（＜40 ℃）吹至近干，將殘余物用75%甲醇水溶液復溶至1 mL。

1.3.3 儀器分析條件

色譜柱：XBridge?BEH C18 2.5 μm 2.1 mm×100 mm Column XP；流動相A：甲醇；流動相B：5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～1 min，流動相A為20%并保持1～2 min，流動相A從20%線性增加至90%，并保持至6 min。6.0～6.1 min，流動相A從90%線性回至20%，并保持至8 min；流速：0.20 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃

離子源：ESI-；檢測方式：選擇反應監測掃描（SRM）；電噴霧電壓：-2 500 V；霧化器蒸發溫度：300 ℃；毛細管溫度：350 ℃；鞘氣：241.32 kPa；輔助氣：68.95 kPa；離子吹掃氣：0 kPa；DNC定量離子對：300.991＞137.008，DNC定性離子對：300.991＞107.097；透鏡電壓：-24 V；碰撞能量：-22 V（定量）/-40 V（定性）；DNC-D8定量離子對：309.156＞141.020，透鏡電壓：-43 V；碰撞能量：-18 V。

2 結果與分析

2.1 凈化效果

凈化能力越強，雜質干擾越小。對于雞蛋樣品，凈化效果為方法2＞方法3＞方法1；對于雞肉，凈化效果為方法3＞方法2＞方法1。方法1是國標方法，前處理采用乙腈提取的同時沉淀蛋白、正己烷脫脂凈化，其提取液與正己烷分界面較渾濁，在目標化合物附近存在一定程度的色譜峰干擾，雜質容易污染色譜和質譜系統，除雜能力有限。方法2是采用80%乙腈水提取，PRiME HLB凈化的方法，該法能有效去除雞蛋、雞肉中的蛋白、脂肪、磷脂和色素[2]。方法3是采用乙腈提取，PSA、C18分散固相萃取凈化的方法，除雜能力優于方法1，樣品提取液較清亮，但對于雞蛋樣品來說，除磷脂能力不及方法2。

2.2 目標物損失情況

采用3種方法分別處理加標樣品溶液（1 ng·mL-1），目標物損失大小依次為方法2（33%）＞方法3（16%）＞方法1（14%）。方法2中PRiME HLB小柱的凈化效果雖好，但是容易吸附DNC和DNC-D8，特別對于雞蛋樣品中目標物的吸附更明顯，容易造成檢出限偏高。方法3中QuEChERS法所用的提取鹽和凈化吸附劑對DNC及其內標物的存在一定的吸附，不及方法1中的國標方法檢出限低。

2.3 基質效應

通過比較DNC在雞蛋和雞肉中的響應情況，考察基質效應，計算公式為：

3種方法的回收率、精密度和基質效應見表1。在3種不同方法處理條件下，雞蛋和雞肉均表現為弱基質增強效應（|ME|＜20%），對離子化的增強效果不明顯[6]。其中，采用方法2處理雞蛋所產生的基質效應最低，方法3處理雞肉所產生的基質效應最低。

2.4 回收率及精密度

采用3種方法對雞蛋和雞肉進行加標回收試驗[7]，見表1。方法2的回收率最低且不穩定，主要由于小柱填料對目標物的吸附影響太大；方法1的RSD均小于5%，穩定性最高；方法3的回收率在83.2%～96.8%，相比其他方法損失最小。

表1 3種方法的回收率、精密度和基質效應表

2.5 實際應用能力

本研究對100組雞肉進行試驗，見表2。3種方法的試劑使用量均不大，對環境和操作人員的影響較小，準確度和精密度均符合相關法規的要求。方法1采用有機試劑來提取加凈化，一步到位，用時較短，成本最低。方法2的凈化效果最好，色譜峰最干凈，用時最短，但是回收率偏低，目標物損失較大，檢出限偏高，實驗成本較大。方法3耗時相對較長，但是回收率高且穩定，成本合適。

表2 3種方法的實際能力表

3 結論

綜合3種方法對雞肉和雞蛋中4，4’-二硝基均二苯脲殘留量的檢測分析，3種方法各有所長，應結合具體實際情況來采用不同的前處理方法，達到相應的實驗目的。方法1穩定性最好，檢出限最低，成本最低，但凈化效果略差，基質效應較大。方法2的凈化效果最好，基質效應最弱，但方法回收率較低，穩定性較差，損失較大。方法3回收率最高，凈化效果和穩定性較好。在保證檢測結果準確性的基礎上，為提高檢測效率，降低成本，方法1和方法3更適合于實驗室中大批量樣品的快速定性定量分析。