Tricine-SDS-PAGE測定花椒籽蛋白 降血壓肽的分子量分布

◎ 吳紅洋

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

降血壓肽（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides，簡稱ACEIP）是一類能夠降低人體血壓的小分子多肽，經研究證實對治療高血壓有很好的療效，通過抑制腎素-血管緊張素系統（Renin-Angiotensin System，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統（Kallikrein-Kinin System，KKS）中的血管緊張素轉化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）活性而降低血壓[1]。降血壓肽來源廣泛，從天然動、植物及微生物都可以提取出來，具有毒副作用低、降血壓效果很明顯等優點，目前人們已用酪蛋白[2]、大豆蛋白[3]、竹子[4]、藻類等制得了ACE抑制肽，因此，降血壓肽已成為目前降血壓藥物研究的熱點之一。

花椒籽蛋白降血壓肽是花椒籽蛋白經特定蛋白酶酶解后制得的具有較高ACE抑制活性的產物，隨著降血壓肽研究的不斷加深，小分子肽活性組分的分離、鑒別也逐漸受到重視[5]。目前測定小分子肽分子量的方法主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜法、凝膠色譜法、質譜法等，其中SDSPAGE電泳法具有設備投入小、操作簡單等優點，受到科研工作者的青睞。常規的Tris-Glycine-SDS-PAGE電泳只能分析分子質量在10～20 kDa的大分子物質，SCHAGGEER等[6]采用改進的三（羥甲基）甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE）能夠有效分離小分子蛋白、多肽。近年來的文獻研究表明，此法對于不同酶解產物的小分子肽的分離條件和分離效果不盡一樣。本文在前期研究基礎上，將花椒籽蛋白降血壓肽作為研究對象，優化Tricine-SDS-PAGE電泳條件，旨在找到一種簡便可行、效果理想的適合花椒籽蛋白降血壓肽分子量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽蛋白，實驗室自制。

SDS-PAGE蛋白質超低分子量多肽（3.3～20.1 kDa），購于上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為2.0×105U·g-1），購于北京華邁科生物技術有限責任公司；Tricine、硼酸、四甲基乙二胺（TEMEND）、聚乙二醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、考馬斯亮藍R250、尿素、甘油、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇及過硫酸銨（AP）等均為分析純；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為電泳純。

1.2 儀器與設備

Millipore Milli-Q型超純水儀（美國Millipore）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（榮華儀器制造有限公司）；冷凍離心機（美國Thermo）；凝膠成像儀；垂直電泳儀（Bio-Rad）；CP225D型電子天平（德國Sartorius）；BP-20型pH計（德國Sartorius）；QL-901型渦旋儀（其林貝爾儀器制造公司）。

1.3 方法

1.3.1 花椒籽蛋白降血壓肽的制備

參考相關文獻[7-8]，得出花椒籽蛋白降血壓肽的制備工藝：花椒籽蛋白→木瓜蛋白酶酶解→滅酶→冷卻→離心→收集酶解液→超濾→凝膠層析→冷凍干燥→保存。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE電泳操作方法

（1）電泳緩沖液的配制。①陽極緩沖液：將24.228 g的Tris溶于800 mL的超純水，用1.0 mol·L-1HCl調pH到8.9，再用超純水定容到1 000 mL。②陰極緩沖液：將6.055 g的Tris、8.958 g的Tricine、0.5 g的SDS溶于超純水，并定容到500 mL。③凝膠緩沖液：將36.3 g的Tris和0.3 g的SDS溶于80 mL的超純水中，用1.0 mol·L-1HCl調pH到8.45，定容到100 mL。

（2）凝膠的制備。取3.0 mL分離膠液灌入模具內至一定高度，用水封頂，聚合完畢（約30 min左右），傾去水層，用濾紙吸凈殘留水。加入2.0 mL的間隙膠并進行水封，待間隙膠凝固后傾去水層，灌入1.5 mL濃縮膠溶液后立即插入干凈的梳子，操作需快速，整個操作過程注意避免氣泡的產生。凝膠的組成見表1。

表1 凝膠的組成表

（3）樣品制備。樣品緩沖液由4% SDS、12%甘油、50 mmol·L-1Tris、2% β-巰基乙醇（v/v）以及0.1%溴酚藍組成，調pH=6.8，室溫存放。取10 μL樣品與等體積的樣品緩沖液混合，沸水浴5 min后離心（10 000 r·min-1，10 min）。

（4）點樣與電泳。將處理好的樣品加入點樣孔，每孔10 μL，同時點入超低分子量Marker作為參比。內槽加入陰極電泳緩沖液，外槽加入陽極電泳緩沖液，電泳開始時電壓為30 V，待樣品完全到達分離膠與間隙膠界面后，90 V恒壓，當溴酚藍指示劑距離分離膠底部1 cm處時，電泳結束。

（5）固定、染色、脫色。取出平板中的凝膠立即浸泡在固定液中固定1 h，再將固定后的凝膠置于45 ℃的考馬斯亮藍染色液中浸泡30～60 min，最后用洗脫液進行脫色，多次變換洗脫液直至電泳條帶清晰、凝膠背景洗脫干凈為止。

（6）成像。用凝膠成像系統成像，并觀察電泳圖譜。

2 結果與分析

2.1 凝膠種類對電泳效果的影響

目前，Tricine-SDS-PAGE電泳法有多種凝膠組合方式，有的是用分離膠、間隙膠和濃縮膠，有的僅用分離膠和濃縮膠。張銳昌等[9]采用三層梯度膠測定出小麥蛋白酶解物分子量的分布情況，而黃薇等[10]、孫波等[11]采用兩層膠的電泳方法獲得了理想的肽電泳顯帶結果。本文首先采用僅灌注濃縮膠和分離膠對花椒籽蛋白降血壓肽進行電泳分離，電泳分離圖譜如圖1所示。

圖1 電泳圖譜圖

由圖1可知，Maker條帶并未完全分離，隨著分子量的降低，電泳條帶堆積現象較嚴重，而樣品除在20 100 Da附近有一個條帶外，幾乎看不見明顯的條帶，可能跟蛋白肽的種類和電泳緩沖液的濃度有關，因為適當的電泳緩沖液能保持蛋白質在電泳系統中的溶解性和穩定性[6]，因此后續將采用三層凝膠對花椒籽蛋白降血壓肽進行分離測定。

2.2 不同分離膠濃度對電泳效果的影響

目前Tricine-SDS-PAGE電泳法測定分子量的方法關鍵在于凝膠的配制，其中不同分離膠的濃度對小分子肽的分離有較大影響。不同凝膠系統的電泳圖譜見圖2。

由圖2可以看出，當分離膠濃度為20%時，隨著分子量的降低，Maker條帶彌散現象嚴重，并且有明顯的拖尾現象，酶解液的條帶在分子量為5 856 Da處呈堆積現象；當分離膠濃度為16.5%和15.5%時，Maker條帶的電泳圖譜背景淺，分辨率得到提高，拖尾現象也有一定改善，而酶解液在20 100 Da和5 856 Da處有條帶，且濃度為15.5%時的電泳效果相對更好。

圖2 不同凝膠系統的電泳圖譜圖

凝膠濃度大且孔徑小時，電泳容易產生拖尾現象，樣品分子不能正常進入凝膠中，導致分離效果不好，反之孔徑大且凝膠濃度小會使來自樣品中的各種蛋白質分子伴隨著緩沖液向前流進，能使條帶能很好的分離，從而降低了分辨率。研究表明，凝膠濃度提高到25%時，實驗的電泳受阻，原因是分離膠孔徑變小，因此凝膠濃度不是越高越好[12]。綜上所述，實驗選擇分離膠濃度為15.5%。

2.3 分離膠中添加甘油對電泳效果的影響

由圖2可知，當分離膠濃度（添加尿素）為15.5%時電泳分離效果最好，但是酶解液條帶不明顯，因此將酶解液經超濾和凝膠層析后進行分離，同時考察甘油對電泳效果的影響。SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示。

圖3 SDS-PAGE電泳圖譜圖

由圖3可以看出，在分離膠濃度15.5%條件下，添加甘油的電泳圖譜中Maker的5個條帶分離效果好，分辨率高。酶解液條帶主要呈連續分布狀態，但在20 100 Da、14 400 Da和5 856 Da附近處有電泳條帶出現，說明該酶解液分子量分布范圍較廣。經過超濾和凝膠層析純化后，分子量降低，超濾液條帶集中在5 000 Da以下，層析液最高活性組分分子量主要集中在3 000 Da以下，說明降血壓肽起抑制效果的活性組分主要在3 000 Da以下。有文獻報道，分離膠中添加尿素或甘油可以增加小分子多肽電泳分離的效果，其中尿素的使用與否主要取決于蛋白質的具體性質，有些蛋白沒有尿素時分離效果更好，但是有些蛋白的分離就需要添加尿素時才能更好分辨[13]，而在分離膠中添加適量的甘油，由于分離膠交聯度不同會對電泳產生一定影響。分離膠的交聯度在C=5%時，會改變膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子比例使其接近標準的20∶1，凝膠分子之間的結構更緊密，使小分子肽更好地分離，條帶更清晰[12]。

3 結論

本文通過優化Tricine-SDS-PAGE電泳條件使得花椒籽蛋白降血壓肽得到較好分離，得到的最佳電泳條件為：分離膠濃度為15.5% T、6% C（添加甘油），間隙膠濃度為10% T、3% C，濃縮膠濃度為4% T、3% C，此條件下花椒籽蛋白酶解液電泳泳帶分布較廣，經純化后，超濾液分子量在5 000 Da以下，層析液最高活性組分的分子量在3 000 Da以下。