PCR法對益生菌產品中雙歧桿菌的鑒別

◎ 相紅麗，雷紅濤，黃惠英，付日留

（1.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.合生元（廣州）健康產品有限公司，廣東 廣州 510663）

益生菌是通過定殖在人體內改變宿主某一部位菌群組成的一類有益的活性微生物。通過調節宿主系統免疫功能或通過調節腸道內菌群平衡，起到促進營養吸收保持腸道健康的作用，被臨床確認主要功效有：調節腸道菌群[1]、提高免疫力[2]、促進營養物質合成和礦物質的吸收[3]、治療腸炎[4-5]以及抗腫瘤[6-7]。近幾十年來，隨著益生菌產品的健康功效被證明，益生菌產品受到廣泛關注[8-9]，被廣泛應用[10]到食品、保健食品和藥品原料中[11-14]。然而，有調查發現一些商業益生菌產品的標識準確性存在問題，包括分類不準確、標識的菌種缺失、添加未申報的菌種等。益生菌產品因為菌株的差異，有益功效也不盡相同[15]，確認益生菌菌株及其活性是確保益生菌產品質量的關鍵。

雙歧桿菌的鑒別主要以雙歧桿菌的生物學特性為基礎，利用分離培養技術[16-18]、形態鑒別或在培養基中添加顯色成分，通過染色試驗進行鑒別[19]，這些方法操作簡單，但特異性差，受操作人員影響較大[20]。以分子生物學為基礎的PCR檢測方法，因其準確、快速、敏感、可靠及分辨率高的特點，在食品的鑒定中有較多應用[21-23]，食源性病原體[24]和鑒別污染來源也有應用PCR技術[25-26]，歐盟關于轉基因生物檢測的黃金標準檢測方法也以PCR分析方法為基礎[27]。PCR鑒別方法在益生菌和雙歧桿菌的鑒別檢測中也取得了長足的進展，并且發現實時熒光PCR方法對食品中雙歧桿菌的檢測也有較好的準確性和可靠性[28]。

本研究主要以PCR技術為基礎，利用Primer Premier 6軟件進行引物設計確定兩歧雙歧桿菌與嬰兒雙歧桿菌共存情況下的特異性引物，特異性引物在PCR體系和反應條件下對雙歧桿菌DNA進行擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，并在128 bp處檢查凝膠電泳的熒光條帶情況，通過顯示長度辨別，確認雙歧鑒別產物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

iQTM SYBR? Green Supermix，美國 Bio-Rad公司；PCR引物，北京擎科生物科技有限公司；濾芯、移液槍頭、1.5 mL/2.0 mL離心管、微量移液器，德國艾本德Eppendorf；瓊脂糖，Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；96孔qPCR板，英國Grant儀器公司；QIAamp? PowerFecal? Pro DNA Kit提取試劑盒，德國QIAGEN公司；DNA梯度標準品，Thermo賽默飛。

漩渦振蕩器，德國IKA；小型高速離心機，英國Grant儀器公司；電泳槽、凝膠電泳呈現系統，美國Bro-Rad公司；超純水機，Milipore上海；NanoDrop 2000c超微紫外分光光度儀，Thermo賽默飛；普通PCR儀、qPCR儀，美國Bio-Rad公司；生物安全柜，新加坡ESCO。

1.2 主要溶液

1%瓊脂糖凝膠配制：0.5 g瓊脂粉溶解到50 mL 1×TAE緩沖液，并加入5 μL DNA染色劑）。Mastermix溶液配制：將Premix Tag/ iQTM SYBR? Green Supermix充分解凍并旋渦振蕩混勻，參照對應的反應體系配制Mastermix溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計

按照產品中添加的嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌的類別，在NCBI數據庫中查找兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的16SrRNA序列信息，使用軟件DNA MAN對比找出序列的同源性，進而找到兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的16SrRNA基因的保守區。依據兩種雙歧桿菌的16SrRNA特異性基因序列并參照國外文獻[29-31]，利用Primer Premier 6軟件進行引物設計，找到最合適兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的種屬特異性引物。實時熒光定量PCR引物的序列[32-33]。上游引物 BifF1：5’-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3’， 下游引物BifR1：5’-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3’，PCR產物長度128 bp。

1.3.2 DNA提取

采用QIAamp Power Fecal Pro糞便DNA提取試劑盒并按照說明，對兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和乳酸桿菌菌粉原料進行DNA提取，提取好后備用。

1.3.3 引物特異性評價

乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌菌粉原料DNA提取物先稀釋至50 ng·μL-1進行均一化，然后再稀釋至5 ng·μL-1作為工作液，最后稀釋至1 ng·μL-1，在PCR反應體系中加入與模板DNA等體積的水作為空白對照，設定樣品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL mastermix至96孔板的孔內，然后在各反應孔內加入5 μL DNA模板用實時熒光PCR板專用封板膜封板。菌粉原料DNA提取物使用雙歧桿菌屬水平特異性引物，按實時熒光定量PCR反應體系（iQTM SYBR? Green Supermix染料，12.5 μL；上游引物，1.25 μL；下游引物，1.25 μL；分子級別無菌水，5.0 μL，DNA 模板，5.0 μL）和熒光定量PCR反應程序（95 ℃，預變性3 min；95 ℃，變性30 s；退火60 ℃，延伸30 s；循環40次，95 ℃，1 min；55 ℃，1 min終延伸）對DNA進行實時熒光PCR擴增實驗，觀察擴增曲線和Ct值。

1.4 PCR鑒別反應體系的構建

1.4.1 PCR反應體系的設計

嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌菌粉原料DNA提取物，加入雙歧桿菌屬水平特異性引物，按照反應體系（Premix Taq?酶，25 μL；上游引物，2.5 μL；下游引物，2.5 μL；分子級別無菌水，15 μL，DNA模板，5.0 μL）、PCR反應程序（95 ℃，預變性3 min；95 ℃，變性30 s；60 ℃，延伸30 s；循環40次，72 ℃，終延伸10 min）對DNA進行PCR擴增實驗。

1.4.2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

上述菌粉原料DNA擴增產物稀釋至50 ng·μL-1進行均一化，然后再稀釋至5 ng·μL-1作為工作液，最后稀釋至1 ng·μL-1，在PCR反應體系中加入與模板DNA等體積的水作為空白對照，系統設定樣品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL MasterMix溶液至96孔板的孔內，然后在各反應孔內加入5 μL DNA模板用實時熒光PCR板專用封板膜封板。樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，吸取5 μL的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳（130 V×35 min）。使用凝膠成像系統對電泳條帶進行分析，拍照判斷菌落屬性。

1.5 乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料菌株鑒別

將乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料，分別按照傳統培養法接種培養出生長完好的菌落，按照上述PCR反應體系和條件進行擴增。擴增后產品按照上述方法進行凝膠電泳，觀察熒光條帶的情況。

2 結果與分析

2.1 引物特異性評

擴增曲線和Ct值如圖1所示。由圖可知，嬰兒雙歧桿菌菌株擴增曲線的Ct值為12.48，兩歧雙歧桿菌菌株擴增曲線的Ct值為13.14。這說明這對特異性引物可以很好的對嬰兒雙歧桿菌菌株、兩歧雙歧桿菌菌株這兩株菌進行qPCR擴增。乳酸桿菌菌株擴增曲線的Ct值為32.23（一般認為樣品的Ct值超過30，就意味著qPCR對此樣品沒有擴增作用），這說明這對引物對乳酸桿菌菌株沒有擴增作用。

圖1 乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌DNA擴增曲線圖

按照引物序列計算PCR擴增產物的長度約為128 bp，凝膠電泳圖如圖2，由圖可知嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌菌株擴增得到很明顯的條帶，而乳酸桿菌菌株沒有得到條帶，說明該引物可以對嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌進行鑒別，無法對乳酸桿菌鑒別。

圖2 菌粉DNA擴增產物凝膠電泳熒光條帶圖

2.2 PCR鑒別體系的建立

乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料培養出的菌落PCR產物凝膠電泳圖如圖3，由圖3可知特異性引物可以很好地對原料中兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌進行鑒別。

圖3 菌落PCR產物凝膠電泳熒光鑒別圖

2.3 復合型益生菌產品中的雙歧桿菌鑒別

在雙歧桿菌選擇性培養基上對復合型益生菌樣品進行培養，選取培養基中益生菌產品生長的完好菌落，按照以上方法進行PCR擴增和鑒別。凝膠電泳熒光條帶顯示均在128 bp左右的長度，說明該方法可以對益生菌產品中的雙歧桿菌進行鑒別。

3 結論

本文成功的設計特異性引物，并驗證了引物可以對嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌進行擴增，但對乳酸桿菌沒有擴增，并確立了適合嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的PCR反應體系和條件，由此，可以實現在嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌共存時，對復合型益生菌產品中雙歧桿菌的鑒別。